牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定步骤
牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定步骤
[db:作者] / 2022-12-20 00:0012.2.5.6测定
(1)液相色谱测定条件
色谱柱: Kromasil 100-5C18,5 μm,150 mm×4.6 mm(内径)或相当者;流动相: 0.01 mol/L草酸溶液-乙腈~甲醇(77+18+5,v/v/v); 流速: 1.0 mL/min;柱温: 40℃; 检测波长: 350 nm;进样量:60 μL。
(2)液相色谱测定
将混合标准工作溶液分别进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下,土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09 min、3.73 min、8.27 min和12.53 min。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图见图12-11。
图12-11 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图
12.2.5.7 分析条件的选择
(1)提取条件的选择
四环素类抗生素分子含有若干亲水的羟基,易溶于水和较低级的伯醇类,在中性和酸性溶液中较稳定。在pH 3~8的范围内离子化,在pH3左右以阳离子形式存在,在pH 7.5以上时以阴离子形式存在。可与二价、三价金属离子阳离子螯合。
牛奶中含有丰富的蛋白质和钙,影响四环素抗生素的提取。采用了20%三氯乙酸、硫酸锌-亚铁氢化钾体系、乙腈等作为蛋白沉淀剂,虽然蛋白沉淀效果较好,但回收率均较低。用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取,并在较低温度下离心,可以起到沉淀蛋白的作用,并掩蔽二价阳离子Ca2+和Mg2+的干扰,可以获得较为满意的回收率,因此选用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液为提取液。
(2)净化条件的优化
在实验中,对比了WCX、Oasis HLB单-固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱加羧酸型阳离子交换柱双柱合用的效果。实验发现,WCX柱净化效果不好且回收率低。单用Oasis HLB固相萃取柱净化,也有较大的干扰峰存在,如图12-12所示;而采用Oasis HLB和羧酸型阳离子交换柱双柱净化,净化效果好,在待测物出峰处无干扰峰,见图12-13。 在对HLB柱的洗脱条件上对比了乙酸乙酯、甲醇以及二者一定比例的溶液,见表12-28。 发现随着甲醇比例的提高,回收率会增加,说明甲醇的洗脱效果较好,当甲醇比例达到50%时和纯甲醇的洗脱效果相差不大,但是考虑到HLB的上样液及淋洗液为水溶液,洗脱溶液有乙酸乙酯存在时,需要对柱体抽干很长时间,洗脱液才能顺利的滴下,所以本方法选择甲醇为HLB洗脱剂。通过试验,用5 mL即可达到完全洗脱的目的。
图12-12 牛奶空白样 品经HLB固相萃取柱净化后色谱图
图 12-13 牛奶空白样品经HLB和Carboxylic Acid双固相萃取柱净化后色谱图
表12-28 不同溶剂对HLB柱的洗脱效果
(3)色谱条件的优化
使用Kromasil 100-5 C18 (150 mm×4.6 mm)液相色谱柱对土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的进行分析,采用0.01 mol/L草酸溶液+乙腈+甲醇溶液(v/v/v)作为流动相,用70+20+10,75+20+5,80+15+5,77+18+5 等不同比例的溶液进行分离,发现以77+18+5比例的流动相可以使4种四环素族抗生素达到很好的分离,并且可以在较短时间内出峰。因此选用此比例的溶液作为流动相。
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