镇静剂类药残留分析技术——提取方法

时间：2023-03-25 01:14:31来源：food栏目：食品快速检测阅读：

镇静剂类药残留分析技术——提取方法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(2)提取方法

1)巴比妥类

乙腈和乙酸乙酯是巴比妥类药物提取中最常用的有机溶剂。

戴晓欣等4采用乙酸乙酯提取水产品中的苯巴比妥，回收率在80.49%～ 102.42%之间，RSD为1.52%～10.15%，方法LOD为10 μg/kg， LOQ为30 μg/kg。由于鱼肉的含水量较高，用乙腈和甲醇提取时，会将大量的水和水溶性杂质提取出来，后面旋转蒸发时间长，测定时有干扰；而用乙酸乙酯作提取溶剂，旋转蒸发时间减少近一半，乙酸乙酯更适合作为水产品提取剂。赵海香等提取猪肝与猪肾中4种巴比妥药物。样品加入无水硫酸钠和乙腈，30℃下超声提取30 min，超声功率450 W，离心后取上清液进一步净化，气相色谱-质谱(GC-MS)测定，外标法定量。4种药物的LOD，猪肝中不高于0.65 μg/kg，猪肾中不高于1.00 ug/kg； LOQ在猪肝中不高于2.20 ug/kg，猪肾中不高于3.35 μg/kg；4种药物回收率为68%～90%，RSD 均低于10%。该作者7还采用加速溶剂萃取(ASE)技术提取猪肉中的巴比妥、异戊巴比妥和苯巴比妥残留。采用乙腈作提取溶剂，压力10.3 MPa持续30 min，溶剂挥发后再进一步固相萃取柱净化。方法平均回收率为84.0%～ 103.0%，变异系数(CV)为1.6%～12%，LOD 为0.5 μg/kg，LOQ为1μg/kg。

巴比妥类药物呈酸性，酸性条件下以分子状态存在，更易进入有机溶剂，能提高提取效率。

我国检验检疫行业标准SNT 2217-2008用酸性乙腈提取鸡肉、猪肉、猪肝和鱼肉中的苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥等6种巴比妥类药物，LC-MSMS测定，方法LOD为1 μg/kg，回收率为78.6%～110%。Wang等测定动物和水产品可食性组织中巴比妥类药物，用无水硫酸钠、酸化乙腈提取，30℃下超声波辅助提取10 min，LC-MS/MS测定，方法平均回收率79.6%～ 108%，CV小于11%， LOQ为0.5 μg/kg。王勇等先用盐酸(pH 1～2)酸化动物心、肝、脾、肺、肾，再用乙醚提取组织中的苯巴比妥。研究发现乙醚提取效率比乙腈高，但提取杂质也多。血液中的巴比妥类药物，可用酸性缓冲溶液(pH 2)直接沉淀蛋白后进样；或用乙腈-甲醇、乙酸乙酯将巴比妥类药物提取至有机相，有机提取液经离心过滤后-般不再净化，可吹干转换到合适溶剂直接测定或衍生化后测定。如果与其他类药物同时提取，则要综合考虑各因素，采取合适提取溶剂。

2)苯二氮卓类

苯二氮卓类药物主要用乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂提取。同时，利用苯二氮卓类药物的碱性特性，在碱性环境下采用有机溶剂提取可提高提取效率。

Gunn等测定血清和全血中12种苯二氮卓类药物(包括阿普唑仑、替马西泮、奥沙西泮、去甲西泮、氯硝西泮、劳拉西泮、地西泮、利眠宁、咪达唑仑、氟硝西泮、7-氨基氯硝西泮和7-氨基氟硝西泮)时，用4℃冷乙腈沉淀蛋白，涡动提取，提取液转换溶剂后进超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)分析。该方法较为简单，但灵敏度较低。张玉洁等1[1采用乙腈提取猪肉中的地西泮残留，在30℃水浴中超声提取10 min。对常用溶剂乙腈、乙酸乙酯、乙腈-水(90+10，v/v)进行比较试验，发现乙腈提取效率最高，杂质最少；乙酸乙酯提取效率也较高，但杂质多于前者。该试验还对30℃、10min超声辅助提取(UAE)和振荡提取两种条件下的提取效率和杂质情况进行了比较，结果发现超声提取效率高，杂质溶解少，而振荡提取的提取效率低，共提取杂质却多于前者。汪丽萍等可用乙腈提取猪肉中的地西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑等4种苯二氮卓类药物。地西泮回收率为60%～70%，RSD为7.6%～12.9%， LOD为2 μg/kg；艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑等3种药物回收率为60%～115%，RSD 为3.8%～19.7%，LOD为10 μg/kg。我国内贸行业标准SB/T 10501-200817，用乙腈提取畜禽肉中的地西泮，匀浆肌肉组织加乙腈在超声波水浴中提取10min。方法LOD为10μg/kg，回收率为70%～9%。

黄士新等测定猪血浆和尿液中的地西泮，对二氯甲烷、正已烷、乙酸乙酯等不同溶剂的提取效率进行了比较，发现乙酸乙酯提取回收率较高且易于浓缩，作为提取溶剂效果最佳。该方法回收率为81.6%～105.4%，RSD 为3.8%～13.6%，LOD为0.5 ug/L。Jang 等用乙酸乙酯提取唾液中25种苯二氮卓类药物，提取液直接进样分析，LOD 为0.01～0.5 ng/mL，LOQ为0.1 ～0.5 ng/mL，回收率为81%～95%。孙雷等测定猪肉和肾脏中的甲喹酮、奥西泮、地西泮、硝西泮和替马西泮等10种镇静剂。研究发现在酶解后，用氢氧化钠溶液调节体系pH 9.7±0.2，然后分别用乙酸乙酯和叔丁基甲醚进行提取，再采取低温脱脂、高速离心等办法进行净化，每种药物均获得了满意的回收率，且能很好地去除杂质干扰。10 种镇静剂的LOD为0.5 μg/kg， LOQ为1 μg/kg，回收率为64.5%～111.4%。钱晓东等用含1%氨水的乙酸乙酯提取水产品中的地西泮及其代谢物，平均回收率为82.1%～119.0%。但肌肉中的大量脂肪亦被同时提取出，需要进一步脱脂净化。于慧娟等用1%氨化乙酸乙酯提取鱼类样品中的地西泮及其代谢物去甲地西泮、替马西泮和奥沙西泮残留，平均回收率为85.7%～105.6%。

谢秀红等建立GC-MS法同时定性分析血液中的安定、硝基安定、氯硝安定、三唑仑、艾司唑仑和阿普唑仑残留。样品用乙醚萃取，50℃水浴中N2吹干，残留物用乙醇溶解后进样分析，方法LOD为5 μg/L。Lee等用甲醇提取毛发中的地西泮、劳拉西泮、去甲地西泮、奥西泮、替马西泮、咪达唑仑和唑吡坦残留，毛发剪碎后用甲醇38℃提取16 h，提取后用固相萃取净化，GC-MS测定。地西泮、劳拉西泮、去甲地西泮、奥西泮、替马西泮的LOD为5 ng，咪达唑仑和唑吡坦的LOD为10ng，LOQ均为10～20 ng，回收率为71%～103%。Fermandez 等建立了微波辅助萃取(MAE) 血浆中阿普唑仑、溴西泮、地西泮、劳拉西泮、氯甲西泮和硝西泮的方法。用8 mL氯仿-丙醇(4+1，v/v)于89℃萃取13 min，回收率为(89.8%±0.3%)～(102.1%±5.2%)。研究表明，萃取时间明显影响萃取效率。

3)吩噻嗪类

吩噻嗪类药物极性有较大差异，其中，异丙嗪极性较小，而赛拉嗪极性较大，常根据极性用氯仿、乙酸乙酯、乙腈和乙醚等提取。但乙醚易生成过氧化物，对氯丙嗪等药物的萃取率影响较大，常加入维生素C以消除过氧化物对吩噻嗪类药物的氧化作用，提高回收率。同时，本类药物均显碱性，在碱性环境下脂溶性升高，用碱性有机溶剂提取，效率提高。

Delahaut等用乙腈提取猪组织中的乙酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰丙嗪、阿扎哌隆等药物。用乙腈振荡提取15 min，肌肉和肾脏的回收率均大于90%。洪月玲等比较了甲醇和乙腈提取猪肉及虾肉中氯丙嗪的效率，试验表明乙腈提取率高，杂质少，提取回收率为80%～101%。Tanaka等用乙腈直接提取血清中的氯丙嗪、左米丙嗪、甲哌丙嗪、奋乃静和异丙嗪等12种吩噻嗪类药物后进样测定，回收率为87.6%～99.8%，检测限为3.2～5.5ng/mL。李春风等用含1%浓氨水的乙腈溶液提取水产品中的氯丙嗪、乙酰丙嗪、丙酰丙嗪、异丙嗪、甲苯噻嗪等5种吩噻嗪类药物效果较好。采用氨化乙腈溶液提取，可抑制碱性吩噻嗪类化合物的离子化程度，降低极性，从而提高其在乙腈中的溶解度。氨化乙腈还用于均质提取步骤，可提高吩噻嗪类药物提取效率，平均回收率为75.7%～87.7%，RSD为9.0%～15.2%。

Cheng等报道了用乙酸乙酯提取猪组织中地西泮、氯丙嗪、异丙嗪和安眠酮的方法。对乙腈、0.1 mol/L盐酸-乙腈(5+95，v/v)、乙酸乙酯、氨水-乙醚(5+95，v/v)、氨水-二氯甲烷(5+95，v/v)、氨水-叔丁基甲基醚(5+95，v/v)和氨水-乙酸乙酯(5+95，v/v)的提取回收率和净化程度进行比较，最后选择乙酸乙酯提取。方法LOD为0.2～0.3μg/kg，L0Q 为0.5～1μg/kg，平均回收率为87.6%～106.8%。陈国征用乙酸乙酯提取尿液中氯丙嗪，方法LOD为0.05 ug/mL，CV为3.05%～4.15%，样品加标回收率为98.1%～101%。吕燕等用乙酸乙酯和1 mol/L氢氧化钠溶液提取猪肝中的氯丙嗪，平均回收率为80.2%～90.6%，RSD为5.9%-8.6%，LOD为1 ug/kg。郑水庆等测定血液中的氯丙嗪时，加入同位素内标地西泮-d5，在大于pH 10条件下用乙酸乙酯-苯(1+1，v/v)提取，回收率为79.9%～85.5%，LOD 为0.3 ng/mL。

Holland等用氯仿提取肾脏中的赛拉嗪及其代谢物2，6-二甲基苯胺(2，6-dimethylaniline)。该提取液直接用于硅藻土固相萃取净化后高效液相色谱(HPLC)测定。牛肾中塞拉嗪和2，6-二甲基苯胺的平均回收率分别为78.3%和87.2%，CV分别为9.51%和9.61%；猪肾中塞拉嗪和2，6-二甲基苯胺的平均回收率分别为80.8%和86.7%，CV分别为7.33%和7.10%。

朱砾等建立了血液中氯丙嗪的测定方法。取血清0.4 mL加内标安定120 ng，再加入1 mol/L NaOH 0.2 mL，加含维生素C的乙醚4mL，旋涡振荡2min，静置1h，取上清液3.5 mL， 40℃水浴氮气流下吹干，用150 μL流动相溶解残留物，取60 μL进行HPLC分析。回收率在92.0%～99.4%之间，LOD为10 ng/mL。苏海滨等IBS用特丁基甲醚-乙腈～5mol/L氢氧化钠溶液(12+0.2+0.2，v/v)提取牛奶中的乙酰丙嗪、氯丙嗪、赛拉嗪等8种镇定剂残留。牛奶中的回收率在86.29%～92.49%之间，RSD在8.99%～20.56%之间；奶粉中的回收率在81.59%～97.49%之间，RSD 在1.76%～16.70%之间；牛奶中的LOD为0.1～0.5 μg/kg，奶粉为0.8～4.0 μg/kg。

4)丁酰苯类

丁酰苯类药物均呈碱性，残留提取同样根据极性和酸碱性选用合适的溶剂提取。

Cerkvenik-Flajs等用乙腈提取猪肾脏中阿扎哌隆和阿扎哌醇，提取液酸化后用MCX固相萃取净化，HPLC测定。阿扎哌隆和阿扎哌醇的平均回收率分别为88.2%和91.2%，实验室内CV分别小于11.0%和9.0%；LOD分别为1.1 μg/kg和1.2 μg/kg， LOQ为5 μg/kg和10 μg/kg。Zawadzka等用乙腈提取猪肾脏和肝脏中阿扎哌隆，回收率为91.2%～107.0%，检测限(CCa)和检测能力(CCβ)分别为125.9 ug/kg和160.0 μg/kg。

Aoki等用1 mol/L NaOH碱化动物组织，使阿扎哌隆和阿扎哌隆呈分子态，再加入正已烷，将药物从碱性组织溶液中萃取入正己烷中。两种药物的LOD均为0.025μg/g，回收率均大于72%。我国国家标准GB/T20763-2006(39)在碱性条件下用特丁基甲醚提取猪肉中氟哌啶醇、阿扎哌酮和阿扎哌隆等药物，提取效率较高，回收率均大于90%。

5)多种类同时提取

多种类镇静剂类药物同时提取和测定，大大提高了检测效率。

常青等建立了体液中巴比妥、异戊巴比妥、苯巴比妥、奥沙西泮、地西泮、硝西泮、氯硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑和三唑仑的定性定量分析方法。血浆样品经0.1 mol/L氢氧化钠溶液碱化后，用乙酸乙酯萃取，萃取液经氮气吹干，再用乙酸乙酯溶解后进行GC-MS分析。10 种药物的回收率均在92%～117%之间，日内、日间RSD在4.09%～ 14.26%范围内，LOD为2～20 μg/L。Bock等开发了一种运用LC-MS/MS测定猪和牛肾脏中镇静剂阿扎哌隆和它的代谢产物阿扎哌醇、氯丙嗪、丙酰丙嗪和乙酰丙嗪、氟哌啶醇和甲苯噻嗪等药物的方法。使用猪的肾脏作为污染的动物样品，测试和验证了不同种类的溶剂以及萃取和净化方式。提取率最高的方法是采用氨水和乙酸乙酯的混合液，振荡提取，不需固相萃取净化。

Mitrowska等用乙腈提取猪、牛肾脏中氯丙嗪、丙酰丙嗪、乙酰丙嗪、三氟丙嗪等吩噻嗪类药物，以及阿扎哌隆和阿扎哌醇的药物残留。提取物用C18固相萃取柱净化后，用LC-MS/MS测定。方法回收率为73.2%～110.6%，CV小于13.0%；CCa为：吩噻嗪类5.8～6.6μg/kg，阿扎哌隆105.5μg/kg，阿扎哌醇121.4μg/kg，CCβ为：吩噻嗪类6.3～7.6μg/kg，阿扎哌隆119.0μg/kg，阿扎哌醇140.0μg/kg。Zhang等用乙腈同时提取组织中的11种镇静剂(苯巴比妥、艾司唑仑、咪达唑仑、地西泮、硝西泮、癸氟奋乃静、氯丙嗪、乙酰丙嗪、氟哌啶醇、塞拉嗪、阿扎哌醇)。通过比较甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为提取液，发现乙腈的提取效果最好，杂质少，回收率最高。猪、牛肌肉、肾脏、肝脏中药物回收率在76.49%～118.6%之间，CV为2.2%～19.9%，LOQ为0.5～2.0μg/kg。

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