聚醚类药物残留测定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

20.1.4.2 测定方法

目前已报道的PEs残留检测方法主要有微生物法(MA)、免疫分析法(IA)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。

(1)微生物法(microbiological analysis，MA)

微生物法具有试样前处理简单、快速、样品容量大、仪器化程度及分析成本低的优点，常作为筛选方法应用在PEs残留分析中。PEs的微生物分析法常用管碟琼脂扩散法，即将敏感试验菌均匀涂布于琼脂培养基表面，向有一定体积的牛津杯(小钢管)加入一定量含抗生素的溶液，使其在培养基上进行扩散渗透，从而产生透明抗生素抑菌圈。在一定浓度范围内，抗生素总量的对数与抑菌圈直径的平方呈线性关系，从而对抗生素进行定量分析。潘蕴慈等用高敏感的嗜热脂肪芽孢杆菌(C-953)作为实验用菌对肉鸡肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中的SAL残留进行测定。用双碟平板培养敏感菌，通过细菌的抑制效应对药物进行检测，用标准曲线定量。组织样品加甲醇匀浆并提取，加四氯化碳LLP净化，再经硅胶层析柱净化后进行测定。标准溶液效价浓度的线性范围为0.05～0.2r，回收率为69.82%～75.79%，方法LOD可以达到0.22mg/kg。李娜建立了鸡组织中SAL、MON和MAD的微生物检测方法。向匀浆后组织加入PBS，振荡30min后，100℃水浴3min，冷却后离心提取组织中的药物，采用管碟法进行检测。试验筛选出MON的敏感菌为金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，SAL的敏感菌为枯草芽孢杆菌，MAD的敏感菌为短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。该方法回收率均大于60%，RSD在15%以内；MON、SAL和MAD在各组织中的LOD范围分别为1.25～1.5μg/g、0.4～0.6μg/g和1.75～2.0ug/g。

(2)免疫分析法(immunoanalysis，IA)

免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础的新型分析技术。目前应用于PEs分析的主要有酶联免疫吸咐测定法(ELISA)和荧光免疫分析法(FIA)等。

1)酶联免疫分析法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)

ELISA是基于抗原或抗体的固相化及其酶标记技术的一种免疫测定方法。底物通过与酶反应催化成为有色产物，产物的量与试样中待测物的量直接相关，从而对待测物进行定性或定量分析。Elissalde等建立了快速ELISA法，用以测定畜禽肝组织中SAL和NAR残留。用SAL-小牛血清蛋白(BSA)制备了16种抗SAL的单克隆抗体，这16种单克隆抗体在10μg/kg范围内用于识别SAL及与其结构相似的NAR用筛选出的抗体“SAL05”建立了一种竞争性ELISA方法进行检测。样品处理用pH7.2的Tris-HCl缓冲液匀浆提取，提取液用上述ELISA法检测。该方法平均添加回收率为87%，标准曲线线性相关系数为0.9838，SAL和NAR的IC50值分别为(0.33±0.10)ng/孔(0.52+0.62)ng/孔，LOD为1000ng/孔。Muldoon等采用ELISA技术建立了鸡肝组织中SAL的检测方法。用免疫蛋白G柱纯化腹水中的抗SAL单克隆抗体，建立了竞争性抑制ELISA方法。组织样品提取缓冲液(pH7.75)包括水、Tris-HCl、Tris碱、氯化钠、NFDM和吐温20，离心提取液后再用该缓冲液稀释，供ELISA检测。方法添加回收率为83%，LOQ为50μg/kg；与高效液相色谱方法的相关性高(p<0.0001)，且更为灵敏。Godfrey等建立了鸡组织中MON的化学发光酶联免疫吸附(cELISA)定量测定方法。通过酶水解从鸡组织中提取MON，再用IAC净化，最后用cELISA定量测定。鸡不同组织中MON的LOD范围在0.09μg/kg(肝脏)和1.99μg/kg(皮肤)之间，肝脏和皮肤的回收率分别为101.05%±10.67%和80.99%±0.19%。

2)荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)

FIA常用标记免疫测定法，以荧光物质或潜在的荧光物质作为标记物，结合免疫反应和标记物的发光分析，通过荧光检测器检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，从而对待测物进行定性或定量分析。Peippo等建立了鸡肉和鸡蛋中NAR和SAL残留的时间分辩荧光免疫测定法(time-resolved fluoroimmunoassay，TR-FIA)。鸡蛋试样用乙腈提取一次并蒸干，复溶；肌肉试样需要再增加硅胶SPE净化，洗脱液为乙腈。用镧系元素铕标记NAR-转铁蛋白结合物，竞争性TR-FIA检测定量。NAR和SAL的平均回收率分别为81.1%和91.0%，LOD分别为0.28μg/kg和0.56μg/kg。TR-FIA同时检测荧光波长和时间两个参数进行信号分辨，有利于排除非特异荧光的干扰，而且镧系元素螯合物Stokes位移较大、发射光谱带窄、荧光寿命长，极大地提高了分析灵敏度和特异性。Wang等建立并优化了用特异性多克隆抗血清检测MAD的荧光偏振免疫测定(FPIA)的方法。MAD-BSA作为免疫原，荧光标记MAD用活化酯法合成，标记物为异硫氰酸荧光素乙二胺(EDF)，薄层色谱纯化。鸡组织样品和全蛋样品用甲醇提取MAD，离心后除去脂滴，900μL硼酸缓冲液(BB)中加入100μL鸡组织甲醇上清液，或者800μL BB中加入200μL全蛋甲醇上清液，稀释后FPIA测定。该方法动态范围在0.01～5.6μg/mL之间，IC50为0.16μg/mL，LOD为0.002μg/mL；鸡肌肉、脂肪和蛋组织在0.25μg/g、5μg/g和10μg/g添加水平的回收率在82%～130%之间。

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