聚醚类药物残留测定方法（三）

时间：2023-03-24 21:13:44来源：food栏目：食品快速检测阅读：

聚醚类药物残留测定方法（三）

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

(5)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是PEs最常用的残留检测方法，该方法具有较高的灵敏度和特异性。PEs的HPLC法可分为直接检测法和衍生化检测法。

1)直接检测法

直接检测法即未经衍生化步骤的分析方法。LAS含酚甲酸荧光基团，可直接使用荧光检测器(FLD)测定，也可用紫外检测器(UVD)测定，但由于灵敏度的原因，UVD多用于饲料和预混剂的测定。Weiss等首次建立了动物组织中LAS的HPLC-FLD测定法。取10g肝脏组织，用乙腈提取，转移部分提取上清液，用己烷洗涤脱脂后，在氮气下吹干，用经1mL流动相饱和的水复溶，再用2mL流动相提取，供HPLC-FLD分析。色谱分析柱为Whatman Partisil 10 PXS 10/25 柱(25cm× 4.6mm，10um)，流动相为四氢呋喃-甲醇-氢氧化铵-己烷(150+30+10+810，v/v) 的上清液和四氢呋喃-甲醇-己烷(150+30+820，v/v)按体积比3：1组成，等度洗脱，流速2mL/min，FLD测定的激发波长为310nm，发射波长为430nm。该方法LOD为25μg/kg，回收率在70%以上。Kaykaty等建立了牛、鸡、狗、大鼠及小鼠血液中LAS的HPLC-FLD直接检测方法。用乙酸乙酯提取LAS，60℃下氮气吹干提取液，HPLC流动相复溶，HPLC分析柱为Partisil P×S 5/25硅胶柱(25cm，5um)，流动相为己烷-四氢呋喃-甲醇-三乙胺-氨水(810+140+20+20+10，v/v)，流速为0.9mL/min，FLD激发波长为310nm，发射波长为430nm。在5μg/kg～5mg/kg范围内，平均添加回收率为84%，CV为4%～8%，线性范围为3.0～500ng/mL。

2)柱前衍生法

除LAS外，其他PEs均无发色基团，在紫外吸收光谱中呈末端吸收(210～220nm)，用常规HPLC法难以直接测定。但其结构中含有众多的活性基团，如羧基、羟基、酮基、缩醛和半缩醛等，可供紫外或荧光衍生化。紫外衍生化方法常采用吡啶重铬酸盐(PDC)衍生化法，荧光衍生化方法常采用9-蒽重氮甲烷(ADAM)衍生化法和1-溴乙酰芘(1-BAP)衍生化法。

A.吡啶重铬酸盐(pyridinium dichromate，PDC)衍生化

Dimenn等采用柱前衍生HPLC法测定了鸡皮肤、脂肪中SAL残留。用甲醇提取，提取液中加入四氯化碳LLP净化，再用硅胶柱和C18柱净化，净化后的SAL洗脱液在氮气下吹干，用二氯甲烷复溶后与10mg PDC混合，室温振荡30min进行衍生化反应，加入1mL 5%碳酸氢钠和1 mL二氯甲烷，振荡，去除水层，将二氯甲烷层用1mL 5%碳酸氢钠洗涤4次，用1 mL水洗1次。将二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥后，过硅胶柱(0.2g) 净化，HPLC测定。流动相为水-四氢呋喃-磷酸-乙腈(60+40+0.1+900，v/v)，色谱分析柱为Altex Ultrasphere ODS柱(25cm×4.6cm)，流速为2.0 mL/min，UVD在225nm检测。该方法LOD为0.1mg/kg，回收率在94%～ 102.1%之间。

B.9-蒽重氮甲烷(9-anthryldiazomethane， ADAM)衍生化

Takatsuki等建立了鸡组织中MON的HPLC-FLD检测法。用甲醇-水(8+2，v/v)提取鸡组织中的MON，用氯仿和水LLP净化，经硅胶SPE柱净化后，40～45℃下旋转蒸干，2mL甲醇复溶，将其加入30 mL 0℃的0.1 mol/L KH2PO4(pH3.0)溶液中混合，酸化处理5 min后再用氯仿LLE溶液中的药物，40～45℃下旋转蒸干有机层，2mL甲醇复溶。加0.5 mL 10 umol/mL的ADAM溶液，室温、避光、过夜进行衍生化反应，40℃旋转蒸干后用2mL二氯甲烷复溶，过硅胶柱净化后，用正相HPLC-FLD测定。色谱分析柱为Nova-PakC18柱(30cm×3.9mm)，流动相为二氯甲烷-甲醇(19+1，v/v)，流速1.0mL/min，激发波长365nm，发射波长412nm。方法的添加回收率在47%～78%之间，CV在1.8%～7.1%之间，LOD为1μg/kg。

C.1-溴乙酰芘(l-bromoacetylpyrene，1-BAP)衍生化

宫川弘之等建立了同时检测鸡组织中MON和SAL的残留分析方法。组织中的SAL和MON用乙腈提取，提取液用乙酸乙酯和水进行LLP净化，取乙酸乙酯层，氮气吹干后用氯仿复溶，再过硅胶SPE柱净化，洗脱液氮气吹干，加2mL 0.2%的1-BAP乙腈溶液，再加100μL 2%的Kryptofix 222乙腈溶液催化，在50℃下反应90min，使SAL和MON生成荧光衍生物，再加入10mL氯仿，过Sep-pak弗罗里硅土柱净化后，用HPLC-FLD测定。色谱柱为L-column ODS(250nm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(96+4，v/v)，柱温40℃，流速1.0mL/min，激发波长360nm，发射波长450nm。方法添加回收率在66.2%～96.2%之间，LOD为50μg/kg。

3)柱后衍生法

尽管PEs有多种衍生化方法，但由于灵敏度不够、过程繁琐等原因使其应用受到一-定限制，而柱后衍生法具有一定的优势，在动物源基质中PEs的柱后衍生HPLC检测中主要为芳香醛衍生化法。Gerhardt等建立了动物组织中MON、SAL和NAR的HPLC检测法。用异辛烷-乙酸乙酯(9+1，v/v)提取药物，过硅胶SPE柱净化后，HPLC检测。色谱分析柱为Intersil ODS-2柱(250mm×3.2mm，5um)，流动相为甲醇-0.01mol/L乙酸铵(94+6，v/v，pH4.0)，流速为0.5mL/min。柱后衍生化试剂香草醛当日配制，将9.5g 99%的香草醛溶于127.5mL冷甲醇-硫酸(125+2.5，v/v)中配成。衍生反应温度为100℃，流速0.3mL/min。UVD检测波长为520nm。NAR、SAL的LOD为5μg/kg，MON为2ug/kg，所有药物的LOQ均为5μg/kg；MON、SAL和NAR的平均回收率分别为94.3%、97.2%和94.1%。Moran等建立了牛可食性组织和奶中MON的HPLC-UVD方法。用甲醇-水(850+150，v/v)作为提取液，过Sep-Pak硅胶SPE净化。色谱分析柱为Whatman Partisil ODS-3柱(25cm×4.6mm)，流动相为甲醇-水-乙酸(940+60+1，v/v)，甲醇-硫酸-香草醛(95+2+3，v/v/w)进行柱后衍生化(防止紫外照射)，流动相和衍生化试剂的流速均为0.7mL/min，衍生反应温度为98℃。产物在520nm处检测。奶和可食性组织的LOQ分别为5μg/kg和25μg/kg，回收率在80%～88%之间。我国农业部于2001年发布的动物源食品中MON和SAL的残留检测方法标准4)，采用HPLC-柱后衍生-UVD法测定鸡肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中MON和SAL的残留。试样用异辛烷提取，经硅胶SPE柱净化后，HPLC测定。色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-冰乙酸-水(94+3+3，v/v)，衍生液为香草醛溶液，流动相和衍生液流速均为0.7mL/min，衍生反应温度为95℃，UVD检测波长为520nm。MON和SAL的LOD分别为50μg/kg和100μg/kg；在100μg/kg添加浓度水平的回收率为80%～110%，批内CV≤10%，批间CV≤15%。

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