阿维菌素类药物残留分析技术——净化方法

时间：2023-03-24 21:04:41来源：food栏目：食品快速检测阅读：

阿维菌素类药物残留分析技术——净化方法

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

(2)净化方法

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP法通过AVMs在不相溶的两相中的溶解度的不同而达到净化目的，但LLP操作麻烦，且净化效果不佳，采用越来越少，常作为其他净化方法的辅助手段。徐英江等研究了水产品中IVM、AVM、EPR、DPR的LLP-HPLC分析方法。样品用异辛烷进行提取，蒸干后用正己烷溶解，再用乙腈进行反萃取净化，用N-甲基咪唑和三氟乙酸酐进行衍生后，HPLC检测。所有药物的LOD均能达到1.0μg/kg；在添加浓度1～50μg/kg范围，平均回收率为78.9%～106%，RSD为5.8%～11.2%。在测定动物组织时，较其他基质的食品，净化的要求更高，有时需要采用异辛烷或正己烷进行LLP除脂。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是目前应用最为广泛的AVMs残留分析净化技术，C8、C18、HLB、硅胶、氧化铝等SPE柱均有用于AVMs残留分析的报道。

A. HLB柱

卢志晓等建立了冻虾中AVM、IVM、DOR、EPR的残留检测方法。试样经乙腈提取、浓缩，用HLB固相萃取小柱净化，UPLC-MS/MS测定。4种分析物在2μg/kg、10ug/kg、20μg/kg加标水平的平均回收率为75.1%～92.5%，RSD为6.78%～9.89%；4种药物的LOD均可达到0.5μg/kg。

B. C8柱

Cerkvenik-Flajs等报道了奶中IVM、AVM、DOR、MOX、EPR及代谢物甲氨基阿维菌素和基奈马克丁的残留检测方法。样品用乙腈提取，过C8固相萃取柱净化，衍生化后用HPLC测定。方法回收率在78%～98%之间，室内CV为4.6%～13.4%，室间CV为6.6%～14.5%；EPR的方法检测限(CCa)为24.8ug/kg，MOX为50.6ug/kg，其他药物在0.1～0.2μg/kg之间。

C. C18柱

贾方等用乙腈提取牛筋中的AVM和IVM，再用C18固相萃取柱净化，净化液经衍生化后，用HPLC分析。AVM和IVM的LOD分别为2.5～4.0ng/g；在3个加标浓度水平下，AVM和IVM的回收率在81.6%～101.0%和101.5%～102.4%之间，RSD均不大于2.0%。Kolberg等用乙腈提取牛奶中的AVM和IVM，提取液过C18固相萃取柱净化，经衔生后用HPLC测定。AVM的LOD和LOQ分别为0.10ug/L、0.18μg/L，IVM分别为0.14μg/L、0.36μg/L；方法回收率在75%～101%之间，RSD小于10%。石艳丽等用乙腈作为血浆中蛋白质的沉淀剂和DOR的提取剂，离心后上清液旋转蒸干，C18固相萃取柱净化后，HPLC测定。方法LOD为0.1ng/mL；样品的回收率为89.5%～95.67%，不同浓度水平的日内CV和日间CV分别小于4%和5%。汪芳等用乙腈提取犬血浆中SEL后，过C18固相萃取柱进行净化，HPLC检测。方法的LOD为0.25ng/mL，CV为1.47%～3.31%，样品平均回收率为94.0%。程林丽等用乙腈提取牛奶中残留的AVM、IVM、DOR和EPR，加水和微量三乙胺稀释，C18固相萃取柱净化，氮气吹干并衍生化后，用HPLC测定。在2～1000μg/kg添加范围，各药物的回收率为70.2%～110.4%，批内CV为3.9%～8.2%，批间为5.1%～8.2%；EPR、AVM、DOR和IVM的LOD依次为0.5ug/kg、0.5ug/kg、0.4μg/kg和0.2ug/kg，LOQ依次为1.8μg/kg、1.6μg/kg、1.3μg/kg和0.8μg/kg。Xia等以乙腈-水为提取剂，采用PLE提取牛组织中的4种AVMs，提取液经C18固相萃取净化和衍生后，HPLC检测。该方法回收率为84.8%～101.8%，RSD小于10.8%；LOD和LOQ分别为0.1～0.2μg/kg和0.5～0.6μg/kg。

D.碱性氧化铝柱

王亮用乙腈提取牛肉中IVM，提取液过碱性氧化铝柱，再用乙腈洗脱，蒸干衍生后，HPLC测定。方法LOD为0.05μg/mL，在1～100μg/mL范围内，回收率在75.9%～96.3%之间。郑卫东等用乙腈提取猪肝脏中AVM和IVM，过碱性氧化铝柱净化后，采用LC-MS/MS检测。该方法LOD均为2.0ug/kg，LOQ为5.0μg/L；在添加水平2～20μg/kg范围，AVM和IVM的平均回收率分别为77.0%～83.3%和76.9%～79.8%，RSD分别小于12.1%和13.0%。杨君宏等用乙腈提取牛肌肉组织中的AVM、IVM和EPR，过碱性氧化铝柱，收集乙腈洗脱液，吹干并复溶后，ELISA试剂盒测定。空白牛肌肉组织中以5ng/g、10ng/g和20ng/g浓度添加时，AVMs回收率为70.9%～108.6%，CV为3.7%～17.1%。

E.中性氧化铝柱

张睿等用乙腈提取动物源食品中的AVM、IVM、DOR、MOX，提取液过中性氧化铝固相萃取小柱净化，经衍生后，再用HPLC进行检测。方法LOD达到0.001mg/kg，回收率在92%～101%之间。

F.硅胶柱

Massarollo等采用甲醇-乙酸乙酯-正己烷提取蜂蜜中AVM，提取液过硅胶固相萃取柱净化后，HPLC测定。方法回收率为73.4%～97.45%，RSD在0.91%～13.7%之间；LOD和LOQ分别为0.002mg/kg和0.007mg/kg。

G.复合柱

张文娟等采用乙腈提取10种食品基质中AVM、IVM、DOR、EPR、MOX和SEL的残留，经PEP-C18混合固相萃取净化后，UPLC-MS/MS测定。3个添加水平下，6种药物的回收率在60%～99%之间，RSD为0.2%～8.9%；6种药物的LOQ均达5.0μg/kg。Wang等采用乙腈提取动物源基质中的AVM、IVM、DOR和EPR，提取液过C18和中性氧化铝串联固相萃取小柱净化后，用UPLC-MS/MS测定。4种AVMs的LOD和LOQ分别为0.05～0.68μg/kg和0.17～2.27μg/kg；方法回收率在62.4%～104.5%之间。

3)免疫亲和色谱(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC是基于免疫反应的基本原理，利用色谱的差速迁移理论，实现分离和分析。首先，将特异性抗体固定在担体上，制成免疫亲和担体，然后填柱。分析时，样品中的待测化合物与吸附剂上的抗体发生抗原-抗体结合反应而被保留在柱上，其他成分被洗脱。随后，通过洗脱溶剂将待测化合物洗脱下来，洗脱液可进行后续分析。抗体制备、担体材料选择、抗体的固定化方式为IAC的关键技术。目前，该方法在残留分析中得到应用。

Li等采取AVM的特异抗体制备了IAC净化柱，用于牛血浆、牛肌肉中AVM的净化处理。经HPLC测定，在6μg/kg、60μg/kg添加水平下，回收率为80%～86%，RSD在5%～14%之间，方法LOD为2μg/kg。Li等叫又利用IVM的多克隆抗体与Sepharose CL-4B偶联，制备IAC柱，对猪肝样品进行净化。甲醇提取液过IAC柱净化后，HPLC检测，IVM的LOD为2ug/kg，5～10μg/kg添加水平下，回收率为85%～102%，CV为6%～12%。

Wu等利用AVM的多克隆抗体制备了IAC柱，用于净化猪肝中AVM和IVM后，LC-MS检测。在5～100μg/kg添加水平，AVM和IVM的回收率分别为74%～94%和65%～87%，LOD为5ug/kg。He等将AVM的多克隆抗体与Sepharose CL-4B偶联，制备IAC柱，用于牛肝中AVM、IVM、DOR和EPR的残留检测。针对该4种AVMs，此IAC柱的动态柱容量分别为3531ng/mL gel、3542ng/mL gel、3543ng/mL gel、3284ng/mL gel净化液经衍生后用HPLC测定，方法回收率为79.3%～11.9%，CV为1.1%～19.4%，LOQ为2ng/g。Hou等也利用AVM的多克隆抗体与Sepharose CL-4B偶联，制备了IAC柱，用于牛肉和牛肝中AVM、IVM、DOR和EPR的分析。洗脱液经LC-MS/MS测定，方法LOD为2.5ng/g，LOQ为5ng/g，在添加浓度5～50ng/g，方法回收率为62.93%～84.03%，RSD在6.02%～17.39%之间。杨君宏等用甲醇提取牛肌肉组织中的AVM、IVM、DOR和EPR，经IAC柱净化，衍生后，用HPLC测定。在5ng/g、10ng/g、50ng/g、100ng/g添加水平下，4种药物的回收率为77.3%～119.5%，CV为1.5%～18.9%，方法LOD为0.8ng/g。

4)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是一种基于SPE的样品前处理技术，可直接处理固体、半固体和黏性液体样品，提取、净化一步完成。其原理是将固相萃取吸附剂与样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。它的独特之处在于样品分离分散在固体表面键合的机相中，成为整个层析系统的一部分，提供样品分离新空间，可以避免样品均化、沉淀、离心、转溶、乳化、浓缩等造成的被测物的损失，节约了分析时间，减少了溶剂用量，操作简单，分析结果相同或优于传统方法。Garcia-Mayor等开发了基于MSPD净化技术，检测羊奶中包括IVM在内7种大环内酯类药物的残留分析方法。将样品与吸附剂混匀装柱，通过筛选吸附剂材料和洗脱条件，试验发现以海砂为分散吸附剂，正己烷洗脱除脂，甲醇-乙酸乙酯(1+1，v/v)洗脱可以获得理想的净化效果和良好的回收率。净化液用HPLC测定，在96.5μg/kg和482.6μg/kg添加浓度，方法回收率为74%和97%，RSD为1.6%～9.0%。

5)分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)

DSPE是一种新的样品前处理技术，该技术的核心在于选择对不同种类的药物都具有良好溶解性能的乙腈作为提取剂，净化吸附剂直接分散于待净化的提取液中，吸附基质中的干扰成分，具有操作简便，处理快速等优点，在多残留分析中大量应用。与SPE相比，DSPE更加简便和快速，以此发展起来的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Rugged，Safe)技术也已在残留分析中广泛采用。Rafidah等开发了采用DSPE技术净化鱼肉中AVM、IVM、DOR、MOX和甲氨基阿维菌素的残留分析方法。匀浆后的样品加入无水硫酸镁和氯化钠，再用乙腈振荡提取，上清液进行DSPE净化。加入氧化铝、PSA和C18吸附剂，充分振荡，去除基质干扰，再离心，蒸干上清液后，LC-MS/MS测定。在添加浓度5μg/kg，对吸附剂的净化效果、准确度和精密度进行考察，发现联合使用PSA和C18对于鱼肉的净化效果最佳。验证实验表明，该方法LOD为0.3～0.4ug/kg，LOQ为1ug/kg；线性范围为1～15ug/kg；回收率在91.9%～102.5%之间，RSD小于19%。

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