β-受体激动剂残留分析技术

时间：2023-03-25 08:22:41来源：food栏目：食品快速检测阅读：

β-受体激动剂残留分析技术

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

1.1.4.1 前处理方法

目前，β-受体激动剂分析涉及的动物源基质主要包括尿液、肝、肾、血液、肌肉等，液液萃取、固相萃取、超临界萃取、双相渗析膜分离等现代前处理技术不断应用到β-受体激动剂的残留分析中来。

(1)提取方法

样品的处理方式会对β-受体激动剂残留分析最终结果产生影响。例如，肝脏在均质过程可能会激活一些降解酶，导致克伦特罗残留量显著降低；而肝脏和肌肉不经过均质处理，直接在-30℃条件下保存，克伦特罗残留浓度在5个月内没有显著变化。

β-受体激动剂，尤其是苯酚型药物如沙丁胺醇，在生物样品中往往会形成结合物，如与葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相结合。因此，在样品提取前需要先进行水解，释放出游离态的药物。目前常用的水解方法包括酶解、酸水解和碱水解。酸水解法中采用的多为稀盐酸、稀磷酸或高氯酸溶液，在水解解除络合作用的同时，还有去除蛋白的作用；碱水解则一般在高温水浴下进行，用于去除蛋白之间二硫键；酶解则是现在采用最多的方法，常用的酶主要有枯草杆菌蛋白酶、葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶等，使用时通过调节样品的pH，使之达到最佳酶解效果。

Haasnoot等研究发现，在尿中约有85%的非诺特罗是以葡萄糖苷酸酶化-硫酸酯蛋白化结合物形式存在。Bogd等对有无酶解步骤对肝脏中沙丁胺醇的提取效果进行比较试验，发现酶解后的结果明显高于未酶解的，约有40%～45%的沙丁胺醇以结合态存在。他们在测定沙丁胺醇时，对β-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶的用量、酶解时间和水解环境进行了研究。当pH为5.2，酶量为1000个单位，温度37℃，水解2h后测得的沙丁胺醇含量趋于稳定。但是，目前还没有数据证明生物样品中的克伦特罗是以结合态的形式存在。

对于以游离态存在的药物，可以直接采用缓冲液或有机溶剂进行提取，影响提取效率的主要为有机溶剂的选择性和缓冲液的pH。常见的提取溶液有乙酸钠缓冲液(pH5.2)、0.1mo/L高氯酸溶液、3%三氯乙酸、乙腈、乙酸乙酯等。刘敏等]比较了乙酸铵提取法、乙腈直接提取法及10%碳酸钠-乙腈溶液提取法对猪肝脏中9种β-受体激动剂残留的提取效果。结果表明，乙酸铵提取法对非诺特罗和喷布特罗等药物的回收率较低(小于20%)：乙腈直接提取法可有效提取出喷布特罗，其回收率达79%，但对非诺特罗的回收率仅为32%；而10%碳酸钠-乙腈溶液提取9种药物的效果明显好于其他两种方法，除了非诺特罗的回收率为72%外，其他8种药物的回收率均在80%以上。基于此建立的猪肝脏中9种β-受体激动剂残留检测的高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，在优化条件下，9种药物在0.50～25ug/kg范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.99；在0.50ug/kg、2.0ug/kg、10μg/kg三个加标水平的回收率为71%～105%，相对标准偏差(RSD)均小于15%；9种药物的检出限均达0.2ug/kg。

(2)净化方法

β-受体激动剂残留分析常用的净化方法有液液分配法(LLP)、固相萃取法(SPE)、基质固相分散萃取法(MSPD)等。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

采用LLP净化提取液中克伦特罗等β-受体激动剂时，往往需将pH调到10以上，再采用乙酸乙酯等有机溶剂进行萃取。对于沙丁胺醇等极性较高的药物，需要在提取溶剂中加入相应的极性组分如异丙醇等来提高萃取效率。金玉娘等建立了同时检测11种β-受体激动剂(包括沙丁胺醇、特布它林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克伦特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马喷特罗、溴代克伦特罗)在猪肉及猪肝脏中残留量的LC-MS/MS方法。将样品粉碎后，用pH5.2的乙酸钠缓冲液提取，经β-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶水解，以高氯酸调节pH，离心沉淀蛋白，分离得上清液，再用异丙醇-乙酸乙酯(6+4，v/v)萃取，再过阳离子交换柱净化、吹干后，用LC-MS/MS测定，同位素内标定量。目标化合物的回收率在89.4%～110.5%之间，RSD为1.1%～2.8%，方法的最低检出限为0.25ug/kg。van der Vlis等建立了一种在线液液电萃取-等速电泳-毛细管区带电泳-电喷雾质谱(EE-ITP-CZE-ESP-MS)方法分析盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、特布它林和非诺特罗。在高电场力作用下，通过液液萃取快速将离子化的β-受体激动剂从低导电率的有机溶剂萃取到一个小体积的缓

冲溶液中，而ITP使分析物远离液-液界面，再经毛细管区带电泳-电喷雾质谱测定。盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和特布它林的检测限可达到2×10mol/L，非诺特罗为5×10mol/L。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

β-受体激动剂主要采用阳离子交换和反相SPE柱进行净化。近年来，以SPE为分离载体的免疫亲和柱(IAC)和分子印迹柱(MIP)等也开始应用。

Whaites等问将牛尿酸化后，用阳离子交换树脂净化，洗脱后再用乙酸乙酯萃取，衍生化后用气相色谱-质谱(GC-MS)检测，内标法定量。增加取样量到50mL时，克伦特罗检测限可达到0.01ng/mL，平均回收率超过70%，变异系数(CV)低于15%。Liu等测定猪肌肉和肝脏中20种β-受体激动剂，样品经β-葡萄糖醛酸酶水解后，用PCXSPE柱净化，使用LC-MS/MS测定。在肌肉和肝脏中，检测限(CCa)范围分别为0.05～0.23ugkg和0.05～0.57 ug/kg，检测能力(CCβ)范围分别为0.11～0.4ug/kg和0.16～0.79μg/kg。金玉娥等“测定猪肉及猪肝脏中11种β-受体激动剂，异丙醇-乙酸乙翻(6+4，v/v)萃取液采用MCX阳离子交换柱净化，目标化合物的回收率在89.4%～110.5%之间，RSD为1.1%～2.8%。

聂建荣等建立了动物尿液中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、妥布特罗、班布特罗、马喷特罗、塞布特罗、齐帕特罗、福莫特罗、氯丙那林、特布它林、喷布特罗和溴布特罗等15种β-受体激动剂的分析方法。样品用高氯酸溶液酸解及沉淀蛋白质，经HLB SPE柱净化、富集后，用LC-MS/MS测定。15种β-受体激动剂在0.25ug/L、1.0ugL、10ug/L添加水平下的回收率为62.1%～107%，RSD为3.5%～9.9%，定量限(LOQ)为0.25ug/L。Koole等则用标准密度的C8提取盘，从人尿和牛尿中提取净化克伦特罗，再用甲醇-0.01mo/L氢氧化钠(25+75，v/v)洗脱，高效液相色谱(HPLC)测定。克伦特罗的回收率为85%，检测限为10ng/mL。

Zhang等以丙烯酰胺为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)作为交联剂，采用本位聚合方法合成了嵌入铜(Ⅱ)的聚合物，对小牛血清蛋白(BSA)具有较强的结合性。该聚合物被用作固定克伦特罗多克隆抗体(pAb)的新型载体，制备出IAC柱。0.1g该固相填料对克伦特罗的最大吸附容量为616ng，食物样品中的提取回收率为84.4%～95.2%，RSD为9.3%～15.5%。反复使用30余次，仍然具有特异性识别。

Van Hoof等l为减小基质效应对液相色谱-质谱(LC-MS)定量的影响，对Clean Screen Dau(CSD)和MIP SPE柱净化尿液中β-受体激动剂的效果进行了比较。首先制备出β-受体激动剂的MIP柱，通过使用不同的制备材料、洗脱溶液和洗脱溶剂，优化出适宜的净化条件。实验显示，CSD对一些β受体激动剂存在假阴性结果，而MIP的选择性更好。

3)基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

最常用的MSPD吸附剂主要为C18。Home等采用MSPD技术对牛肝中的克伦特罗进行提取净化，使传统操作过程得到简化。首先将酶解后的组织试样与MSPD等级的C18吸附剂均匀混合后填柱，用不同的溶剂对杂质和目标物分别进行洗脱，采用放射免疫方法检测，方法回收率在86%～96%之间。洪振涛等将均质后的试样与C18、石墨化碳黑、中性Al2O3混合研磨后装入层析柱，分别用正己烷和氨化甲醇洗涤和洗脱试样中的克伦特罗和沙丁胶醇，再用GC-MS测定。添加浓度为0.05～25.0ug/kg时，样品回收率在94.82%～107.69%之间，CV小于5.52%，克伦特罗和沙丁胺醇的检出限分别为0.0096ug/kg和0.0078 ug/kg。

4)超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

随着新的净化技术的发展，一些新技术如超临界流体萃取法(SFE)等，也开始应用到β-受体激动剂残留分析的前处理中。Jimenez-Carmona 等国对离子对-SFE提取净化食品基质(饲料、冷冻干燥的牛奶和肝)中克伦特罗的技术进行了研究。将食品基质与硅藻土混合，再加入樟脑磺酸，作为抗衡离子与克伦特罗形成极性很小的离子对，使之更容易溶解于超临界CO2。SFE在383bar、40℃下动态提取30min。方法回收率在12%～87%之间，RSD为15%。

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