糖皮质激素类药残留分析技术——前处理方法（二）

时间：2023-03-25 03:05:34来源：food栏目：食品快速检测阅读：

糖皮质激素类药残留分析技术——前处理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(3)净化方法

GCs的净化通常采用液液分配(LLP)、沉淀、固相萃取(SPE)来完成，近年来也有使用免疫亲和色谱(IAC)、基质固相分散(MSPD)以及QuEChERS等净化技术的报道。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

样品中的脂肪通常加入正已烷进行LLP去除。

李存等用乙腈提取猪肝脏中的地塞米松和倍他米松。在猪肝脏样品中加入15mL乙腈，混匀后以4000r/min离心2min，收集提取液于50mL离心管中，在残渣中加入10mL乙腈，匀质30s，以4000r/min离心2min，合并两次提取液，加入10mL正已烷和4mL乙酸乙酯，涡旋混合1min后，以4000r/min离心2min，然后吸取中间层于50mL梨形瓶中，加入5mL正丙醇，在50℃水浴中旋转浓缩至干，用1mL甲醇溶解残渣，待全部残渣溶解后加入10mL纯水，混匀后C18固相萃取柱净化，进行LC-MS/MS分析，同位素内标法定量分析。地塞米松和倍他米松的LOD分别为0.12μg/kg和0.14μg/kg，LOQ分别为0.42μg/kg和0.47μg/kg；在添加浓度0.75～2.0μg/kg范围内，平均添加回收率为97.3%～111%。

李飞等用乙酸乙酯提取速冻调制肉制品中的GCs，正已烷LLP去除杂质，LC-MSMS测定。方法的LOD为0.2～1.0μg/kg，LOQ为0.5～2.0μg/kg，添加回收率范围为85.0%～96.4%，RSD为2.3%～6.1%。

徐锦忠等用乙腈超声提取鸡肉和鸡蛋中泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、倍氯米松及氢化可的松，正己烷LLP脱脂净化后，进行LC-MS/MS分析。该方法的LOQ为0.5μg/kg；在0.5μg/kg、1.0μg/kg和5.0μg/kg浓度添加水平，平均回收率为73.4%～108.9%，RSD为3.4%～13.4%。

Zhang等采用LLP技术提取净化血浆和尿液中的氢化可的松和泼尼松龙。1mL样品中加入6mL乙酸乙酯，混匀，室温静置10min，1789g离心20min，收集乙酸乙酯层，水相再用1mL乙酸乙酯萃取1次，静置，离心，合并乙酸乙酯层，40℃水浴氮气吹干，250uL甲醇复溶，HPLC检测。方法的回收率为88.4%～104.4%；尿液中泼尼松龙的LOD和LOQ分别为1.7ng/mL和5.2ng/mL，氢化可的松的LOD和LOQ为0.8ng/mL和2.5ng/mL；血浆中泼尼松龙的LOD和LOQ分别为1.0ng/mL和3.0ng/mL。

2)沉淀法(precipitation)

生物基质(如牛奶)中含有大量的蛋白质，会干扰GCs残留分析，常采用试剂沉淀的方法来去除。通常加入氢氧化钠、三氯乙酸、三氟乙酸等溶液脱蛋白。

李飞等用乙酸乙酯提取组织中的GCs，残渣中加入0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL，混匀，再加乙酸乙酯20mL，涡旋混合，振动15min，8000r/min离心15min，移取乙酸乙酯层，合并两次提取液，LC-MS/MS测定。方法的LOD为0.2～1.0μg/kg，LOQ为0.5～2.0μg/kg，添加回收率范围为85.0%～96.4%，RSD为2.3%～6.1%。侯亚莉等在碱性条件下用乙酸乙酯提取牛肉中地塞米松、倍他米松和倍氯米松，正己烷LLP脱脂，固相萃取柱净化后，进行LC-MS/MS分析。方法的LOD和LOQ为0.5μg/kg和2.0μg/kg；方法回收率在77.6%～97.9%之间，批内CV为2.5%～7.9%，批间CV为3.1%～8.7%。Iglesias等在牛肝中加入氢氧化钠溶液，再用乙酸乙酯提取地塞米松，蒸干，乙腈复溶后，用正己烷LLP，再用HPLC测定。方法回收率80%以.上，LOD为0.2ppb，重现性为10.7%，重复性为6.2%～8.9%。

Caretti等用纯水将5mL牛奶稀释到20mL，加入300μL三氟乙酸酸化，涡动混匀1min，超声5min，6000r/min离心10min，再用10mL 2%三氟乙酸溶液洗涤蛋白沉淀物2次，C18固相萃取柱净化后用LC-MS/MS测定。13种GCs的回收率超过70%，日间RSD小于12%。Cherlet等向牛奶中加入三氯乙酸沉淀蛋白，过滤，再用固相萃取柱净化，LC-MS/MS测定。地塞米松的LOQ为0.15ng/mL，LOD为41pg/mL；检测限(CCa)和检测能力(CCβ)分别为0.48ng/mL和0.76ng/mL；方法回收率高于56%。该作者采用类似的方法检测牛血浆中的地塞米松，加入三氯乙酸沉淀蛋白后，用乙酸乙酯提取，LC-MS/MS测定，方法LOQ可以达到1ng/mL。

3)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

GCs残留净化常用的SPE柱填料主要有C18、HLB、氨基、MCX和硅胶等。

李存等将猪肝提取液在50℃水浴中旋转浓缩至干，用1mL甲醇溶解残渣，待全部残渣溶解后加入10mL纯水，混匀后过C18固相萃取柱净化，进行LC-MS/MS分析，内标法定量。地塞米松和倍他米松的LOD分别为0.12μg/kg和0.14μg/kg，LOQ分别为0.42μg/kg和0.47μg/kg；在添加浓度0.75～2.0μg/kg范围内，平均添加回收率为97.3%～111%。该作者还开发了牛奶中地塞米松和倍他米松的残留检测方法。样品直接过C18固相萃取柱富集净化，洗脱后LC-MS/MS分析。技术指标满足法规要求。VandenHauwe等用C18固相萃取柱净化牛肝中的11种GCs，LC-MS/MS检测。禁用GCs的CCa和CCβ在0.08～0.38μg/kg之间，倍他米松、地塞米松、强的松龙和甲基强的松龙在0.1～0.5μg/kg之间。

吴敏等采用SPE技术净化猪肉中地塞米松、倍他米松和倍氯米松。在提取液中加入磷酸盐缓冲溶液，在弱酸性条件下过HLB固相萃取柱，使待测物保持正离子态而被吸附在固相萃取柱上。依次用5mL水、磷酸盐缓冲溶液、水淋洗，再用2mL二氯甲烷洗脱，LC-MS/MS检测。方法回收率在83%～96%之间，地塞米松、倍他米松和倍氯米松的LOQ分别为1μg/kg、1μg/kg、2μg/kg。Hidalgo等建立了尿液中地塞米松的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法。样品经酶解后，过HLB柱净化，衍生化后，用GC-MS测定。该方法比较了HLB和C18固相萃取柱的净化效果，发现HLB净化效果好、回收率高，可以显著降低基质的本底信号，方法LOD可以达到0.2ng/mL。邹晓春等用乙酸钠-乙酸缓冲溶液提取肉中5种GCs，再过HLB柱净化，LC-MS/MS测定。平均加标回收率在86.2%～102.8%之间，RSD小于10.4%。

李飞等建立了速冻调制肉制品中GCs的残留检测方法。样品经乙酸乙酯提取后，过硅胶SPE柱净化，最后用乙腈定容，经LC-MS/MS测定。采用外标峰面积法进行定量，该方法的LOD分别为0.2ug/kg、0.5μg/kg、1.0ug/kg，LOQ分别为0.5ug/kg、1.0ug/kg、2.0μg/kg；添加回收率范围为85.0%～96.4%，RSD为2.3%～6.1%。Mllinson等分析牛、猪和羊肝、肉中的地塞米松，样品在氢氧化钠存在的条件下用乙酸乙酯提取，离心，有机相过硅胶SPE柱净化，再用HPLC测定。肝脏和肌肉的回收率分别大于70%和60%，LOD为1.4ppb。

侯亚莉等建立了牛肉中地塞米松、倍他米松和倍氯米松的残留分析方法。样品在碱性条件下经乙酸乙酯提取，正已烷LLP脱脂，通过MCX固相萃取柱净化后，进行LC-MS/MS分析。方法的LOD和LOQ分别为0.5μg/kg和2.0μg/kg，三种药物添加水平为0.5μg/kg、2μg/kg和50μg/kg时，方法的回收率在77.6%～97.9%之间。Salem等采用乙醚-环己烷提取血液中的倍他米松及其乙酸和磷酸酯，MCX固相萃取柱净化后，LC-MS/MS测定。倍他米松的LOD为0.50ng/mL，其乙酸酯的LOD为1.00ng/mL，在2.0～200.0ng/mL范围呈良好线性。

为了提高净化效果，也有采取联合用柱的方式进行净化。

Shao等建立同时测定猪肉、猪肝、猪肾中16种GCs的残留分析方法。酶解液首先用石墨化碳黑(ENVI-Carb)柱净化，然后再用氨基柱进一步净化，LC-MS/MS测定。16种药物的线性范围在1～250μg/L之间，LOQ在0.1～1.0μg/kg之间，在添加浓度0.4～2.0μg/kg的回收率为81.0%～112.3%。Kaklamanos等联合使用HLB和氨基SPE柱净化肌肉组织中的GCs。肌肉组织经水解，甲基叔丁基醚提取，正已烷脱脂，氮气吹干，甲醇-水(1+9，v/v)复溶，OasisHLB净化，HLB柱用3mL甲醇活化和3mL平衡，上样后用3mL含5%甲醇的2%氨水溶液(v/v)，3mL含40%甲醇的2%氨水溶液(v/v)和3mL水分别洗涤，3mL丙酮-甲醇(80+20，v/v)洗脱，洗脱液直接通过已用3mL丙酮-甲醇(80+20，v/v)预淋洗的氨基柱，收集流出液，于55℃水浴中氮气吹干，加入600μL甲醇复溶，再于55℃水浴中氮气吹干后，加入100μL甲醇复溶，LC-MS/MS检测。方法的CCa和CCβ分别为0.03～0.14ng/g和0.05～0.24ng/g。崔晓亮等联合使用HLB、硅胶、氨基SPE柱净化牛奶中的12种GCs。试样经甲醇提取，正已烷脱脂，SPE净化。HLB柱依次用6mL甲醇、6mL水活化后，将试样溶液过柱，先用6mL水淋洗，再用6mL甲醇洗脱；洗脱液用氮气吹干后，加入3mL正已烷溶解，过硅胶柱，用6mL正己烷淋洗，再用6mL水饱和的乙酸乙酯洗脱；洗脱液用氮气吹干后，加入3mL甲醇～乙酸乙酯(40+60，v/v)溶解，过氨基柱，收集流出液，再用3mL甲醇-乙酸乙酯(40+60，v/v)洗脱，合并流出液，用氮气吹干，加入甲醇溶解，用LC-MS/MS测定。该法的LOD为0.02～0.38μg/kg，LOQ为0.07～1.27μg/kg；回收率为69.3%～94.3%，RSD为3.5%～16.7%。

4)免疫亲和色谱(immunafinity chromatography，IAC)

IAC以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为基础，当含有待测组分的样品通过IAC柱时，固定抗体选择性地结合待测物，其他不被识别的样品杂质则不受阻碍地流出IAC柱，经洗涤除去杂质后将抗原-抗体复合物解离，待测物被洗脱，样品得到净化。其优点在于对目标化合物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品痕量组分的净化与富集。Bagnati等报道了采用IAC提取牛尿中地塞米松和倍他米松的检测方法。以含地塞米松抗体的硅胶填料装柱，制备IAC柱，连入HPLC系统，用作在线提取和净化。尿液直接进样，收集HPLC净化后的组分，经浓缩、N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化后，采用GC-MS测定。方法LOD为：地塞米松0.1ng/mL，倍他米松0.2ng/mL。牛晋阳等建立了猪肉中GCs多残留分析方法。样品经甲醇提取，IAC柱净化后，采用LC-MS/MS检测分析。在低、中、高3种质量浓度加标回收率均为78%～101%，LOD为0.2～2μg/kg。

5)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是将样品与填料一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒表面，制成半固态后装柱，然后根据“相似相溶”原理选择合适的洗脱剂洗脱。该技术浓缩了传统样品前处理中匀浆、组织细胞裂解、提取、净化等多个过程，避免了待测物在这些过程中的损失，提取净化效率高、耗时短、节省溶剂、样品用量少，但研磨的粒度大小和填装技术的差别会使淋洗曲线有所差异，不易标准化。Desi等报道了采用MSPD技术净化牛奶中地塞米松和氢化波尼松残留的方法。研究比较了C18、C8、C4、C2、Phenyl等填料的净化效果，发现C2填料净化后共萃取的脂肪较少，且过柱速度更快，将提取、净化、浓缩合为一步，简化和加快了样品前处理步骤。该方法取4g的C2吸附剂，用5mL甲醇冲洗2次后与10g牛奶样品充分混合，加入3mL乙腈再次充分混合，静置5min，加入8mL水混合，抽干，20mL水洗涤，真空抽干5min后，连在弗罗里硅土SPE柱(用5mL正已烷和10mL乙腈平衡)上面，用20mL乙腈洗脱，洗脱液于55℃下氮气吹干，2mL乙腈复溶，1mL正己烷液液萃取3次，乙腈层氮气吹干后，用250μuL流动相复溶，HPLC检测。地塞米松和氢化波尼松的LOD分别为0.075μg/kg和0.50μg/kg，回收率分别为52.9%～64.7%和59.0%～64.1%，RSD分别为3.0%～4.1%和2.9%～5.1%。

6)QuEChERS (Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)

QuEChERS是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。其原理与HPLC和SPE相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。连英杰等建立鸡肉中4种GCs多残留的QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定方法。称取5.00g鸡肉样品于50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯，均质1min，再加入pH12氢氧化钠缓冲液5mL，涡旋1min，4000r/min离心5min，收集.上清液移入50mL离心管，试样残渣中再加入10mL乙酸乙酯均质离心重复提取一次，合并上清液。离心管中加入0.6g分散剂(PSA50mg，bulk carbograph 7.5mg，C18EC 50mg，硫酸镁50mg)，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上层液体过有机滤膜，采用UPLC-MS/MS检测。4种药物在相应的浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.991；在3个加标水平下的平均回收率为84.4%～94.1%，RSD为7.5%～12.5%；LOD和LOQ分别为0.37～9.55μg/kg及1.11～28.65μg/kg。

上一篇：糖皮质激素类药物理化性质

下一篇：糖皮质激素类药残留分析技术测定方法——毛细管电泳法