糖皮质激素类药残留分析技术测定方法——免疫分析法

时间：2023-03-25 02:57:52来源：food栏目：食品快速检测阅读：

糖皮质激素类药残留分析技术测定方法——免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(5)免疫分析法(immunoassay，IA)

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA将放射性的灵敏度与免疫的特异度融合于一体，既简便准确，又灵敏可靠。Blahova等报道了采用RIA测定血清、血浆和尿液中的氢化可的松的方法。采用RIA试剂盒直接检测样品中氢化可的松的含量，无需提取，而尿液样品既可以直接检测也可以提取后检测。样品与包被有氢化可的松示踪剂(125I标记)的单克隆抗体孵育1h，水平400r/min振荡1h，多通道γ计数器检测，标准曲线计算氢化可的松的浓度。该RIA方法的线性范围为3.64～725ng/mL，LOQ为3.64ng/mL，CV为0.27%～13.%。采用HPLC和该RIA方法对66份鲤鱼样品进行分析，相关性为HPLC=0.9454RIA+0.40676，相关系数为0.815。

2)酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)

ELISA是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，灵敏度高，操作安全，不需要昂贵的仪器，可以满足大批量快速筛选的需求。

Roberts等报道了采用ELISA方法检测马尿中的地塞米松。药物-蛋白结合物被固定在微孔板上，抗体与样品或标准品和药物-蛋白结合物竞争。抗体与固定在微孔板上的药物-蛋白结合物结合的比例可以被原位测定，而达到定量目的。该方法在0.75ng/mL、1.5ng/mL、5.0ng/mL三个添加浓度回收率为102.0%～141.7%。与RIA法比较，并经GC-MS验证，该ELISA方法不仅快捷、方便，而且准确率高。胡拥明等分别以地塞米松、倍他米松、双氟米松为半抗原制备抗体，结果发现地塞米松抗体的群选性最强，对双氟米松、倍他米松、曲安西龙和泼尼松龙的交叉反应率分别为120%、73%、37%和21%，对其他3种内源性类GCs交叉反应率均小于0.1%。由此建立了间接竞争ELISA方法检测鸡肌肉组织中的GCs。1g组织样本，加入3mL的蒸馏水，涡旋混合1min，加入4mL的乙酸乙酯，摇动样本30min，4℃下2000r/min离心10min，吸取1mL的上清液于玻璃试管中，50℃时在适当的氮气流下进行挥发T燥，将残渣溶解于0.5mL 10%甲醇的PBS溶液，ELISA检测。该方法的回收率为61.3%～80.3%，CV小于15%，地塞米松、倍他米松、双氟米松的LOD分别为0.14ng/mL、0.56ng/mL和0.21ng/mL。同时，将ELISA方法与LC-MS法对比，相关系数为0.9981，表明两者具有很高的相关性。Kolanovic等建立了可以在欧盟MRL或要求检出水平(RPL)下快速、灵敏地定性筛查测定牛奶与尿液中地塞米松、倍他米松、氟米松和泼尼松龙，以及肝脏样品中地塞米松、氟米松和泼尼松龙的ELISA方法。依据欧盟2002/657/EC标准，通过测定CCβ、特异性、LOD、LOQ、回收率、实验室内重现性、线性和耐用性等对建立的定性筛查方法进行确认。牛奶、尿及肝脏样本的LOD分别为0.2μg/kg、1.2μg/kg和0.6μg/kg，LOQ分别为0.3μg/kg、1.2μg/kg和1.4μg/kg。地塞米松、氟米松、β-米松和泼尼松龙的添加回收率分别为68%～131%、57%～120%、60%～155%、23%～32%，CV在1.6%～21.2%之间。所有被测基质中CCβ低于MRL/RPL。通过适度改变肝脏和牛奶样品前处理中一些关键因素对可靠性进行评价，结果发现未对GCs检测造成任何不良影响。

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