喹诺酮类药物残留分析技术前处理方法——净化方法

时间：2023-03-25 02:50:13来源：food栏目：食品快速检测阅读：

喹诺酮类药物残留分析技术前处理方法——净化方法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)净化方法

经典的净化处理方法有固相萃取(SPE)。随着科学技术的发展和曾药残留检测要求的不断提高，各种新技术、新手段也被用来作为生物样品中QNs的样品前处理方法，主要包括:固相微萃取(SPME)、基质固相分散萃取(MSPD)、分散固相萃取(DSPE)、分子印迹(MIP)、免疫亲和色谱(IAC)等。

1)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

QNs的SPE净化方法主要用于极性溶剂提取组织样品后的净化。通常在SPE净化前需要用正已烷进行脱脂。常用的SPE填料主要包括硅胶基C18、聚乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯等聚合物(如PSDVB、ENV+、SBD-RPS、HLB、StrataX等)、离子交换剂(如SCX、PRS、MPC)和纳米纤维等。QNs为酸碱两性物质，所以SPE固相基质对QNs的保留主要依靠样品载液的pH。Golet等将样品溶液调节为pH3.0，用MPC固相萃取柱净化，回收率达80%以上。Ferdig等专门比较了三种不同的聚合固相萃取柱OasisHLB、IsoluteENV+、Lichrolut EN+和三种不同的硅胶基反相柱Chromabond C8、Chromabond Tetracyeline、Bakerbond phenyl的保留、净化效果，结果发现，以上6种是柱对两性QNs均能有很好的回收率，而对酸性QNs如OXO、FLU的回收率较差。Bailac等建立了SPE-HPLC方法检测鸡组织中的7种QNs(CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU)。比较了Oasis HLB、Oasis mAX和SDB-RPS固相萃取柱的净化效果，除了CIP在Oasis MAX柱的回收率低于25%，其他QNs在3种SPE柱都可以取得满意的回收率，而SDB-RPS用于样品前处理效果最好，回收率为58%～107%，LOD为10～30μg/kg。Samanidoua等用HLB固相萃取柱净化鱼肉中的7种QNs(CIP、ENR、SAR、DAN、OXO、NAL、FLU)。1g鱼肉中加入5mL 0.1mol/L NaOH溶液和0.2g NaCl，涡动1min，超声15min后，3500r/min离心10min，取上清液。再向组织中加入3mL 0.1mol/L NaOH溶液和0.1g NaCl，涡动、超声、离心，重复提取1次，合并上清液，0.2um滤膜过滤，HLB固相萃取柱净化。方法的回收率为90%～132%，RSD低于20%，LOQ为6～8ug/kg。赵思俊等建立了SPE-HPLC法检测动物肌肉组织中7种QNs的残留。该方法采用在不借助高速离心的条件下(3500r/min)，用较短时间(涡动10s，离心5min)，以0.05mol/L磷酸盐溶液(pH7.0)提取两次、HLB固相萃取柱净化的前处理方法。应用该方法在3h内可完成32个组织样品的前处理(包括提取、净化)。在整个提取、净化过程中仅使用了不到5mL甲醇。猪肉、鸡肉中的平均回收率为70.4%～105.8%。邓思维等建立了纳米纤维SPE-HPLC检测汤液中5种QNs的分析方法，样品经EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH4)提取后，纳米纤维(磺化聚苯乙烯-聚乙烯吡咯烷酮共纺物纤维)SPE小柱净化富集，水淋洗，2%氨化甲醇洗脱，HPLC-FLD于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测，流动相为甲醇-水-磷酸(25+75+0.1，v/v/v，三乙胺调至pH2.8)。FLE、NOR、SAR、CIP和ORB的回收率为72.1%～110.3%；日内RSD为1.6%～4.3%，日间为2.0%～4.3%，LOD为1.2-5.4g/L，LOQ为3.9-18g/L。

2)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME具有操作简便、不需溶剂、萃取速度快，便于实现自动化以及易于与色谱、电泳等高效分离检测手段联用，并适用于气体、液体和固体样品分析的、新颖的样品前处理技术等突出的优点。与SPE相比，SPME法具有萃取相用量更少、对待测物的选择性更高、溶质更易洗脱等特点。黄京芳等采用毛细管整体柱管内SPME与HPLC在线联用测定血浆中的OFL、CIP、NOR、ENR和SAR。经过对5种QNs在整体柱上的萃取条件进行系统优化，选用25mmol/L磷酸盐缓冲液(pH4.1)为固相微萃取携带液，解吸液和流动相均为25mmol/L磷酸盐缓冲液(pH2.1)-甲醇-乙腈(72+20+8，v/v/v)，萃取时间为10min，萃取流速为0.04mL/min。结果在测定血浆中的5种QNs时，无基质干扰现象，LOD为1.1～2.6μg/L。Theodoridis等建立了SPME方法净化尿液中的CIP、奎宁、萘普生、氟哌啶醇和紫杉醇，离线HPLC-DVD检测。研究发现CIP在中性环境萃取效率最高，萃取液为0.9% NaCl溶液，解吸液为甲醇，萃取时间为20min。CIP的回收率为85%，LOQ为0.4μg/mL。

3)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是将样品与填料一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒表面，制成半固态后装柱，然后根据“相似相溶”原理选择合适的洗脱剂洗脱。该技术浓缩了传统样品前处理中匀浆、组织细胞裂解、提取、净化等多个过程，避免了待测物在这些过程中的损失，提取净化效率高、耗时短、节省溶剂、样品用量少，但研磨的粒度大小和填装技术的差别会使淋洗曲线有所差异，不易标准化。乔凤霞等以C18为MSPD分散剂，采用MSPD技术进行样品前处理，建立了MSPD-HPLC法分析牛奶和蜂蜜中4种QNs的方法，2.5ng/g和10.0ng/g添加水平，平均加标回收率为81.9%～11.6%，RSD低于7%，LOD为0.05μg/L。王炼等建立了MSPD-LC-MS/MS方法测定畜禽肉和牛奶中的β-内酰胺类、大环内酯类和QNs等20种兽药残留，样品与C18填料(粒径40～75um)混合，进行MSPD提取，以甲醇洗脱待测物，氮气吹扫，流动相溶解残余物后分析，方法的LOD和LOQ分别为0.05～3.05g/kg和0.16～10.0g/kg，禽畜肉和牛奶样品的回收率分别为73.8%～101.5%和71.2%-～95.3%，RSD分别为2.0%～13.5%和2.0%～14.1%。

4)分散固相萃取(dispersive solid-phase extraction，DSPE)

DSPE是在SPME的基础上发展起来的一种新型样品前处理技术。Tsai等建立了DSPE方法净化猪肌肉组织中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。5g肌肉组织置于50mL离心管，加入5mL乙腈(含50μL 70%～72%高氯酸)，均质后加入2g无水硫酸镁和1g氯化钠，振荡混合1min，10000r/min离心4min，取1.5mL上层乙腈溶液加入装有30mg分散吸附剂(PSA)的离心管中，立即加入10uL 1 mol/L氢氧化钠溶液，涡动混合10s，6500r/min离心1min后，用玻璃移液管尽可能移去溶液层，固体吸附剂用氮气吹干，500μL解吸溶液(水-乙腈-70%-72%高氯酸溶液)(10+2+88，v/v)加到干燥的吸附剂中，涡动混合30s，6500r/min离心1min，过0.45um滤膜，HPLC分析。回收率为95.5%～111.0%，LOD为7.5～26.3μg/kg。曹鹏等建立了DSPE-UPLC-MS/MS同时检测食材中11种QNs的方法。样品用5%甲酸乙腈溶液提取后加入盐析剂分层，提取液中加入C18和PSA填料进行净化，浓缩后经C18色谱柱分离，用电喷雾离子源正离子多反应监测模式串联质谱进行检测。11种药物在1.0～100.0μg/kg范围内具有较好的线性关系，相关系数均大于0.998。该方法的LOD为1.8～3.1μg/kg，LOQ为6.0～10.3μg/kg；11种药物的回收率为70.1%～100.3%，RSD为2.42%～10.88%。

QuEChERS是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。其原理与DSPE相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。曲斌等建立了生鲜牛乳中8种QNs的QuEChERS-UPLC-MS/MS测定方法。取生鲜牛乳样品5g，加入5mL 0.1mol/L的EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH4.0)和20mL乙腈，振荡提取20min，再加入Bond-ElutQuEChERS萃取剂振荡提取5min，4℃下1000r/min离心5min，取.上清液10mL置于净化管，涡旋1min，4℃下1000r/min离心5min，取上清液，氮气吹干，复溶后UPLC-MSMS测定。方法对QNs的测定线性范围为2.0～100μg/kg，在2.0μg/kg、10ug/kg、100μg/kg低、中、高3个浓度的回收率为80%～120%，批内、批间RSD小于20%。Karami-Osboo等报道了使用QuEChERS分散液-液微萃取法萃取测定牛奶样品中的6种QNs(MAR、NOR、CIP、DIF、ENR和DAN)。DAN和其他QNs的LOD分别低于2.5μg/kg和15μg/kg，回收率为69.2%～104.8%，日内和日间RSD分别为2.1%～11.1%和1.6%～6.5%。曹慧等采用QuEChERS-UPLC-MS/MS技术同时测定乳制品中磺胺类和QNs残留。样品加乙腈提取，经QuEChERS净化后，采用C18色谱柱分离，以乙腈和0.1%的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾-正离子多反应监测模式，内标法定量。在1～200μg/L的质量浓度范围内，磺胺类和QNs的相关系数均大于0.9965，该方法的LOD在0.3～2.5μg/kg之间，LOQ在1.0～7.5μg/kg之间；添加10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三个浓度水平，磺胺类和QNs的平，均回收率在71.6%～120.7%之间，RSD在0.1%～7.2%之间。

5)分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)

MIT是指为获得在空间结构和结合位点上与模板分子相匹配的聚合物制备技术，是一门源于高分子化学、生物化学、材料化学等的交叉学科。分子印迹就是仿照抗原抗体的形成机理，在印迹分子(imprinted molecule)周围形成高交联的刚性高分子，除去印迹分子后在聚合物的网络结构中留下具有结合能力的反应基团，对模板分子表现出高度的选择识别能力。MIT作为净化方法被广泛用于QNs的前处理，如分子印迹固相萃取(molecularly imprinted solid-phase extraction，MISPE)、磁性分子印迹聚合物萃取(magnetic molecularly imprinted polymer extraction，MMIPE)、水兼溶性分子印迹固相萃取(water-compatible molecularly imprinted solid-phase extraction)等。

刘芃岩等建立了复合模板印迹聚合物净化LC-MS法测定鱼肉中QNs残留。该研究同时以LEV和CIP为模板分子，a-甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)为交联剂，合成了复合模板分子印迹聚合物(MIP)，以此聚合物制备MIP-SPE柱，富集净化鱼肉样品，结合高效液相色谱-离子阱质谱(HPLC-ITMS)同时测定鱼肉中10种QNs残留量的方法。采用2%醋酸乙腈提取样品，提取液经正己烷脱脂后，过自制的复合模板MIP-SPE柱净化，以0.05%甲酸溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱程序进行色谱分离，离子阱质谱进行定性和定量分析。方法的回收率为80.6%～104.6%，RSD小于8.6%，LOD为0.11～0.25μg/kg，LOQ为0.35～0.84μg/kg。汪雪雁等建立了分子印迹固相萃取-高效毛细管电泳检测鸡肉中ENR的方法。以ENR为模板分子，MAA为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，制备了ENR的MIP。以该聚合物为固相萃取材料制备MIP-SPE柱，采用高效毛细管电泳分离，紫外检测器检测。结果ENR的LOD为92.02ug/kg，LOQ为336.04μg/kg，回收率为77.84%～86.52%，RSD为2.18%～3.76%。Sun等在甲醇-水体系中以OFL为模板分子、MAA为功能单体合成水兼溶性MIP，并以此聚合物为吸附剂制备SPE柱，分离净化尿液中的9种QNs(PIP、OFL、ENO、PEF、NOR、CIP、ENR、GAT、SAR)。结果显示，对QNs具有高亲和力，净化后HPLC检测，LOD为0.036～0.10μg/mL。Urraca等采用MIP微球选择性萃取鸡肌肉样品中的6种QNs，用组合筛选的方法选择最佳聚合物合成的功能单体和交联剂。MIP的制备使用ENO作为模板，MAA和三氟甲基丙烯酸混合作为功能单体，EDMA作为交联剂与其他材料相比显示出较高的QNs识别特性。使用二氧化硅作为骨架制备MIP球状粒子，聚合物装填于固相萃取柱内，用体积比为20：80的乙腈-水(含0.005%三氟乙酸，pH3.0)冲洗，含5%三氟乙酸的甲醇洗脱，HPLC或者液相色谱-质谱(LC-MS)检测。鸡肌肉样品中目标QNs的回收率为68%～102%，RSD为3%～4%(n=18)，LOD为0.2～2.7μg/kg。

6)免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography，IAC)

IAC是以免疫结合反应为基础的柱色谱技术。其原理是将抗体与惰性基质偶联制成免疫吸附剂，装柱。当待测组分流经IAC柱时，抗原与相应抗体进行选择性结合，其余杂质则流出IAC柱。再利用适宜的洗脱剂将抗原洗脱，使待测物得到有效分离、净化和浓缩。并且IAC柱再生处理后可重复使用。混合抗体免疫亲和柱(multi-immunoaffinity，MIAC)和高效免疫亲和色谱(high-performance immunoaffinity chromatography，HPIAC)是其发展方向。MIAC是指含多种抗体或群特异性抗体的IAC柱，它能同时对多种组分进行分离净化，具备了处理多残留组分的能力。HPIAC多采用键合相硅胶或控制孔径的玻璃珠，是IAC的选择性和HPLC高效分离的完美结合。

Holtzapple等以SAR为半抗原制备抗体并与蛋白G偶联，制备免疫亲和色谱柱，采用自动在线免疫亲和色谱方法提取鸡肝脏中的4种QNs，免疫亲和色谱柱洗涤后，QNs被直接洗脱到苯基反相色谱柱，以2%乙酸-乙腈(85+15，v/v)为流动相，等度洗脱，荧光检测器检测，激发和发射波长分别为280nm和444nm。结果发现，样品基质无干扰杂质，净化良好。在3个添加浓度(20ng/g、50ng/g和100ng/g)的回收率为85.7%～93.5%，SD低于5%，LOQ为1ng/mL，CIP、ENR、SAR、DIF的LOD分别为0.47ng/mL、0.32ng/mL、0.87ng/mL和0.53ng/mL。在另外一项研究中，Holtzapple等以SAR为半抗原制备高亲和力的单克隆抗体并与蛋白G偶联，制备HPIAC，将HPIAC直接与HPLC连接，分离和检测血清中的2种QNs。由于抗体的高选择性，该方法没有使用有机溶剂和传统的液相色谱柱。ENR的回收率为89%～102%，平均回收率为94%，LOD为0.8ng/mL；SAR的回收率为91%～106%，平均回收率为98%，LOD为1.7ng/mL。Holtzapple等还建立了在线HPIAC-反相HPLC-FLD方法检测牛血清中的4种QNs(CIP、ENR、SAR、DIF)。HPIAC与反相HPLC相连接，FLD的激发和发射波长分别为280nm和444nm。CIP、ENR、SAR、DIF的平均回收率分别为99.2%、102.3%、97.8%和101.49%，平均日内RSD和平均日间RSD分别为3.0%和4.9%，LOD分别为3.2ng/mL、1.8ng/mL、4.7ng/mL和2.8ng/mL，4种QNs的LOQ为3.2ng/mL。Li等建立了新型MIAC方法，将磺胺类和QNs的广谱特异性单克隆抗体同时偶联与Sepharose4B，制备出可以同时分离和净化猪和鸡肌肉组织中13种QNs和6种磺胺类药物的IAC柱，LC-MS/MS检测。以磺胺甲嗯唑为半抗原制备的一种新型单克隆抗体对6种磺胺类药物的交叉反应率为31%～112%，通过优化相关条件，所制备IAC柱可以同时分离净化QNs和磺胺类药物。动物组织中19种药物的回收率为72.6%～107.6%，日内和日间的SD分别低于11.3%和15.4%，LOQ为0.5～3.0ng/g。赵思俊等利用IAC净化技术建立了可同时检测动物肝脏组织中10种QNs(MAR、CIP、NOR、DAN、LOM、ENR、SAR.DIF、OxO和FLU)的HPLC检测方法。对利用QNs抗体制备的IAC柱的性能、操作条件进行了考察和优化。抗体的偶联量为5g/L，其对10种QNs的柱容量为3.75～6.67umol/L gel (1425～2135mg/L gel)，选用甲醇-PBS(7+3，v/v)作为洗脱溶液，连续使用12次后，QNs的柱容量仍能达到初始柱容量的38%～45%。IAC柱重复使用20次后，药物的回收率与样品的净化效果无明显变化。动物肝脏组织样品用PBS溶液提取，IAC柱净化，HPLC-FLD检测，方法的线性范围为0.15～200μg/L，相关系数大于0.9989，LOD为0.05～0.15μg/kg，10种QNs在动物肝脏的平均回收率为74.7%～94.8%，RSD为3.9%～12.1%。

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