糖皮质激素类药残留分析技术测定方法——液相色谱-质谱法

时间：2023-03-25 02:59:18来源：food栏目：食品快速检测阅读：

糖皮质激素类药残留分析技术测定方法——液相色谱-质谱法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(4)液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

在GCs残留分析中，HPLC法难以区分互为差向异构体的地塞米松和倍他米松，而GC-MS虽然可以做定性分析，但是需要复杂的衍生化过程。随着LC-MS技术的发展，已经成为检测这类药物的首选。主要采用电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)两种电离方式。

1)APCI电离

Cherlet等建立了定量测定牛奶中地塞米松的LC-APCI-MS/MS检测方法。10mL牛奶中加入20%三氯乙酸(w/v)，涡动混匀后离心，沃特曼滤纸过滤，C18固相萃取柱净化，LC-MS/MS检测。方法CCa和CCβ分别为0.48ng/mL和0.76ng/mL。该作者等还采用类似的技术建立了牛血浆和组织中地塞米松的测定方法。方法LOQ为：肌肉、肾0.375ng/g，肝1ng/g，血浆1ng/mL；LOD为：肌肉0.09ng/g，肾0.13ng/g，肝0.33ng/g。

2)ESI电离

A.单级质谱(LC-MS)

Pavlovic等报道了采用液相色谱-单级四极杆质谱(LC-MS)测定牛尿中皮质醇、可的松、泼尼松龙和泼尼松的方法。样品过滤、酶解和SPE净化后，进LC-MS分析。Restek UItra II Allure Biphenyl色谱柱分离，等度洗脱，在EST、SIM模式下，监测离子[M+COOHT-]-、[M-H+]-和[M-H+-CH2O]-，以氟米松为内标定量。方法RSD小于17%。Panderi等报道了采用ESI技术检测绵羊血浆中地塞米松的LC-MS方法。使用65%甲醇-水溶液(含0.1%甲酸，v/v)作为流动相，流速0.30mL/min。在ESI正离子、SIM模式下检测。方法线性范围在6～1000ng/mL之间，日内、日间RSD均小于24.1%，方法LOD和LOQ分别为1ng/mL和6ng/mL。

B.串联质谱(LC-MS/MS)

Chen等建立了牛、猪、羊可食组织中8种GCs的LC-MS/MS测定方法。样品采用PLE提取，LC-MS/MS在ESI负离子模式下，采用选择反应监测(SRM)测定。在0.5～6μg/kg添加浓度范围内，方法回收率在70.1%～103.1%之间，LOQ在0.5～2μg/kg之间。Shao等建立了LC-MS/MS同时测定猪肉、猪肝、猪肾中16种GCs的残留分析方法。经BEHC18色谱柱分离后，在ESI负离子模式下采用LC-MS/MS测定。16种药物的线性范围在1～250μg/L之间；LOQ在0.1～1.0μg/kg之间；在添加浓度0.4～2.0μg/kg范围，回收率为81.0%～112.3%。Tolgyesi等建立了一种应用LC-MS/MS同时测定牛肌肉、肝脏和肾脏样品中8种GCs残留的方法。该作者首次应用LC-MS/MS测定了牛组织中甲泼尼松及其主要代谢物。研究表明，较强的样品净化效果能够产生更加干净的监测基线，可以在MS/MS检测器中设置较高的电子倍增电压(DeltaEMV)。EMV为500V时信号的响应得到了改善，但是噪声水平没有变化，因此，总体灵敏度和分析限得到了提高。在HPLC分离中，使用Kinetex phenyl-hexylcore-shell柱，使地塞米松和其β-差向异构体、β-米松在12min内被洗脱并能够实现基线分离，进一步提高了灵敏度。每种基质中GCs的LOQ和LOD范围分别为0.01～13.3μg/kg和0.01～0.1μg/kg。Dusi等建立了同时测定肝脏中9种GCs的LC-MS/MS方法。肝组织经酶解后萃取，OasisHLB固相萃取柱净化，采用LC-MS/MS在ESI模式下，以氘标记内标物进行定量测定。分析样品中浓度大约为1μg/kg的GCs均能被检测到，所有待测物的回收率均高于62%，重复性和再现性分别均低于7.65%和15.5%。Deceuninck等采用UPLC-MS/MS技术建立了肝脏样品中地塞米松、倍他米松、泼尼松龙和甲泼尼龙的残留分析方法。通过选择性较强的样品前处理，结合UPLC-MS/MS高灵敏度测定系统，将地塞米松和倍他米松两种异构体有效分离，可以定性和定量测定复杂生物基质中这4种GCs。结果表明，该方法具有较好的重复性，即使在非常低的浓度水平也能鉴定化合物。Tolgyesi等建立了猪脂肪中5种GCs(泼尼松龙、甲基强的松、氟米松、地塞米松和甲泼尼龙)的LC-MS/MS检测方法。样品用正己烷溶解，甲醇-水(50+50，v/v)提取，HLB柱净化后，进LC-MS/MS分析。以pH5.4甲醇-乙酸缓冲液为流动相，Ascentis Express Fused-Coretype色谱柱分离，等度洗脱，7.5min内完成分离测定。方法平均回收率在81%～100%之间，室内重现性为8.0%～20.5%；具有限量化合物的CCa为4.5～11.9.ug/kg，禁用化合物为0.1～0.2ug/kg；方法LOD在0.1～0.3μg/kg之间。

Li等建立了同位素稀释LC-ESI-MS/MS法，快速同时测定牛奶中的地塞米松和倍他米松。样品直接用C18固相萃取柱净化，洗脱液氮气吹干，流动相溶解，采用Hypercarb色谱柱，以乙腈-水-甲酸溶液(95+5+0.5，v/v)为流动相，进行LC-MS/MS检测，D-4地塞米松作为同位素内标进行定量分析。虽然地塞米松和倍他米松互为差向异构体，Hypercarb C18液相色谱柱很容易将它们快速分离，且峰形较好，在空白组织中未见干扰。研究还发现，GCs在ESI质谱中的准分子离子峰有[M+H]+、[M-H]-、[M+HCOO]-等多种形式。该方法选择[M+HCOO]-作为准分子离子峰，并对质谱条件进行优化。优化后各离子对锥孔电压均为25V，m/z437/361和m/z441/363两离子对碰撞能量为20eV，m/z 437/307.4离子对碰撞能量为35eV。该方法用于牛奶中地塞米松和倍他米松的残留检测，单个样品的总分析时间约35min。崔晓亮等建立了UPLC-MS/MS检测牛奶中的12种GCs(泼尼松、泼尼松龙、可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、地塞米松、倍氯米松、氟米松、醋酸氟氢可的松、布地耐德、曲安奈德、氟轻松)残留的方法。牛奶试样经甲醇提取，正己烷脱脂，SPE净化，UPLC-MS/MS分析。色谱柱为C18柱(100mm×1.0mmi.d，1.7μm)，柱温40℃，样品温度10℃，进样体积2μL，流动相为0.1%甲酸溶液和甲醇，线性梯度洗脱，流速0.1mL/min；EST电离，毛细管电压3.00kV，锥孔电压45V，射频透镜1和2的电压分别为27.0V和0.0V，离子源温度99℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气流量500L/h，碰撞梯度为2.0，多反应监测(MRM)模式检测。该方法的LOD为0.02～0.38μg/kg，LOQ为0.07～1.27μg/kg，回收率为69.3%～94.3%，RSD为3.5%～16.7%。

Yang等利用LC-ESI-MS/MS检测肌肉、牛奶和肝脏中的50种同化激素(包括曲安西龙、泼尼松、可的松、氢化可的松、泼尼松龙、氟米松、醋酸氟氢可的松、甲泼尼龙、倍氯米松、地塞米松、曲安奈德、氟轻松、布地奈德、丙酸氯倍他索等GCs)。样品经芳基硫酸酯酶/葡糖醛酸糖苷酶于37℃过夜水解，甲醇提取，石墨化炭黑和氨基SPE柱净化，LC-ESI-MSMS测定。方法LOQ为0.04～2.0μg/kg，平均回收率为76.9%～121.3%，CV为2.4%～21.2%。

童颖等建立了同时测定猪血浆中二丙酸倍他米松及其代谢物倍他米松的LC-MS/MS法。血浆样品经酸化后以乙醚-环已烷(4+1，v/v)提取，LC-MS/MS分析。以HederaODS-2(150mm×2.1mm，5um)为分析柱，流动相为5mmol/L醋酸铵溶液(含0.1%乙酸)-甲醇，梯度洗脱。二丙酸倍他米松、倍他米松及内标布地奈德的监测离子对分别为m/z563.2([M+CH3COO]-)→483.1、m/z451.2([M+CH3COO]-)→361.0和m/z489.3([M+CH3COO]-)→357.1。二丙酸倍他米松血药浓度在26.85～644.4ng/L范围内线性关系良好，倍他米松血药浓度在10.62～637.2ng/L范围内线性关系良好。雍莉等建立了LC-MS/MS方法同时测定血浆中的肾上腺素、去甲肾上腺素、可的松和氢化可的松。样品经乙腈沉淀蛋白和萃取后，15000r/min离心5min，取上清液进样分析。ESI正离子检测，MRM方式定量分析。肾.上腺素、去甲肾上腺素、可的松和氢化可的松在0.02～200.00ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.999，LOD分别为4.13pg/mL、4.64pg/mL、4.29pg/mL和4.52pg/mL，日内和日间精密度分别为1.19%～5.42%和2.16%～6.04%，用于血浆样品分析，加标回收率为80.0%～109.0%，样品测定精密度为3.93%～7.57%。Leporati等采用LC-MS/MS开发了尿液中泼尼松龙及其4种代谢物的分析方法，LOD在0.35～0.42ng/mL之间。

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