四环素类药物残留分析技术——前处理方法（一）

时间：2023-03-25 01:53:47来源：food栏目：食品快速检测阅读：

四环素类药物残留分析技术——前处理方法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

12.1.4.1 前处理方法

(1)提取方法

TCs在弱酸性溶液中比较稳定，此外，TCs分子能与多种金属离子形成整合物或络合物，易于与基质蛋白质和固定相中的硅醇基键合，因此，常在弱酸性溶剂中加入Na2EDTA来提取TCs。常用的提取溶剂包括Mcllvaine缓冲溶液、Na2EDTA溶液、柠檬酸溶波、磷酸盐、氨水、水8、20%三氯乙酸溶液、乙腈(1mmol/L三氯乙酸调pH4.0)、Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈、Mcllvaine缓冲溶液-乙腈、EDTA-乙腈、0.1mol/L琥珀酸钠溶液(pH4.0)琥珀酸盐(0.1mol/L，pH4.0)-甲醇、柠檬酸盐缓冲液-乙腈和草酸-乙腈等。TCs检测常用的样品提取方法有液液萃取(LLE)、超声辅助萃取(UAE)、加速溶剂萃取(ASE)、液相微萃取(LPME)等。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

LLE 是兽药残留分析中最常用的提取方法。通过机械性振荡，用试剂将分析物从液态/固态样品基质中提取出来其特点是简单，但也有易于乳化，消耗试剂多等缺点。

Wang等利用高温态水的化学行为与有机溶剂相似的原理，采用亚临界水提取技术对样品进行预处理，以5.5mL的水在100℃下加热5min(盐酸调pH2.0)提取动物性食品中的CTC、OTC残留，高效液相色谱(HPLC)检测，回收率为为82.1%～90.0%。与采用乙酸乙酯作提取溶剂的超声提取方法进行比较，后者对几种抗生素的提取率仅为为52.0%～74.2%。结果表明高温态亚临界水的提取效率高，且样品无需净化和浓缩，避免了使用有机溶剂对环境造成的污染蓖麻属Castellari等采用氨水提取猪和牛毛发中的OTC。取250mg干净的毛发用8mL 0.1mol/L氨水在40℃水浴中超声提取30min，0.5mol/L盐酸中和提取液，25mL EDTA-Mellvaine缓冲溶液(pH4.0)稀释，SEP-PakPlusC18柱净化，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测。OTC的检出限(LOD)为9.2ng/g。连文浩等采用Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH4.0)提取鳗鱼组织中的CTC、TC、OTC 5.0g鳗鱼组织中加入20mL Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液，涡动混合，以4000r/min转速离心10min，水层移入150mL分液漏斗中，离心管内的残留物按上述步骤重复提取一次，合并水相到同一分液漏斗中加入正已烷20mL，用振荡器剧烈振荡5min后静置分层，固相萃取柱(SPE)净化，UPLC-MS/MS分析方法的平均回收率为70.6%～93.4%，相对标准偏差(RSD)为6.3%～10.5%，定量限(LOQ)为5.0μg/kg。Li等以0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取，在线SPE-HPLC检测蜂蜜中五种TCS分别用甲醇、Na2EDTA-Mllvaine溶液预先活化以C18为固相吸附剂的SPE柱，测得在50～1000ng/g浓度范围内几种TCS的线性关系良好，LOD为5～12ng/g。杨等开发了基于双水相萃取的离子液体-阴离子表面活性剂萃取方法，应用于蜂蜜中TC和OTC的提取样品用Na2EDTA溶液混合，再加入十二烷基硫酸钠、离子液体1-辛基-3-甲基咪唑溴化物和氯化钠，超声振荡，离心，形成了含水的两相，分析物在上层溶液中作者对影响提取效率的因素，如离子液体的体积、盐的种类和量、pH值、提取时间和温度等也进行了比较研究.在优化条件下，TC和OTC的回收率在85.5%～110.9%之间，RSD小于6.9%，LOD分别为5.8μg/kg和8.2μg/kg。宋等也开发了一种基于离子液体的液液微萃取方法提取鸡蛋中的TC、OTC、DC和CTC离子液体1-丁基-3-甲基咪唑镎六氟磷酸盐被证明具有最佳的性能在优化条件下，方法回收率在58.6%～95.3%之间，CV小于6.2%，LOD为2.0～12ng/g。

2)加速溶剂萃取(加速溶剂萃取)

ASE是指在高的温度(50～200℃)和压力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下，用溶剂萃取固体或半固体样品的新颖样品前处理方法。与传统提取方式相比，ASE速度快、溶剂用量少、萃取效率高、待测组分回收率好，可实现全自动安全操作，在TCs残留分析的前处理也有文献报道。

Yu等采用ASE提取猪、鸡和牛肌肉、肝脏中的CTC、TC、OTC、MNC、MTC、DMCT和DC残留。乙腈(1mmol/L三氯乙酸调pH4.0)为提取溶液，经优化后的ASE的最佳条件为：压力65bar，温度60℃，静态萃取时间5min，静态循环2次，冲洗溶剂体积为池容积的50%。HPLC检测，方法的LOD和LOQ分别小于10μg/kg和15μg/kg，平均回收率为75.0%～104.9%，变异系数(CV)低于10%。Blasco等建立了ASE方法提取牛、猪、家禽和羔羊肌肉组织中CTC、TC、OTC和DC残留。水为提取溶液，经优化后的ASE的最佳条件为：压力1500psi，温度70℃，静态萃取时间5min，静态循环1次，冲洗溶剂体积为池容积的60%，提取液经HLB柱净化，高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测。方法平均回收率高于89%，日内和日间CV分别低于15%和17%；LOQ为0.5～1.0μg/kg，检测限(CC)和检测能力(CCβ)分别为101～116μg/kg和112～130ug/kg。

3)超声辅助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超声波辐射压强产生的强烈机械振动、扰动、乳化、扩散、击碎和搅拌等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行：优点是萃取速度快，价格低廉、效率高。也有报道采用UAE技术来提高TCs的萃取效率。

Zhou等采用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH4.0)提取蜂胶中的CTC、TC、OTC、DC，在2.0g蜂胶中加入20mL的Na2EDTA-Mllvaine缓冲溶液，超声辅助萃取30min(50℃，100W，40kHz)，SPE净化，HPLC检测。方法的LOQ为100～150ng/g，回收率为61.9%～88.5%，CV为4.80%～13.2%。

Zhao等测定牛奶中的OTC、TC、CTC、MTC和DC时，10mL牛奶用1mol/L盐酸调pH4.0，超声波辅助萃取5min，8000g离心10min，取上清液，30mL正已烷萃取2次，取下层的水相。有机相用2mL水洗涤1次，水相真空旋蒸浓缩至小于10mL，甲醇定容至10mL，0.22um滤膜过滤，取20uL进样，HPLC分析。方法的回收率为88%，CV低于4.3%，LOD为10～25ng/mL。

4)液相微萃取(liquid phase microextraction，LPME)

LPME是一个基于分析物在样品及小体积的有机溶剂(或受体)之间平衡分配的过程，是在LLE的基础上发展起来的。与LLE相比，LPME可以提供与之相媲美的灵敏度，甚至更佳的富集效果；同时，该技术集采样、萃取和浓缩于一体，灵敏度高，操作简单，而且还具有快捷、廉价等特点；另外，它所需要的有机溶剂也是非常少的(几微升至几十微升)，是一项环境友好的样品前处理新技术，特别适合于环境样品中痕量、超痕量污染物的测定。

Shariati等建立了载体介导的中空纤维LPME方法，提取和净化牛奶、人血浆和水样品中的TC、OTC、DC。11.0mL样品和0.05mol/L Na2HPO4(9.1≤pH≤9.5)加到有4mm×14mm搅拌棒的12.0mL小瓶中，放置到搅拌器上，用25uL的微量注射器吸取25μL提取缓冲液(0.1mol/L h3PO4，1.0mol/L NaCl，pH1.6)，将针头插入中空纤维的管中，将中空纤维浸入10%季铵盐(Aliquat-336)-辛醇溶液中(w/v)约10s，使针头中充满该溶液，然后将中空纤维浸入水中约10s，以去除中空纤维表面的季铵盐(Aliquat-336)-辛醇溶液；缓慢推出微型注射器的柱塞使提取溶液进入中空纤维，用铝箔封闭中空纤维的一端，将中空纤维放入样品小瓶中，提取35min后取出中空纤维，微型注射器吸取提取溶液，直接进样HPLC分析。方法的萃取百分率为24.8%～44.5%，CV为4.3%～8.9%，LOD为0.5～1.0μg/L。

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