四环素类药物残留分析技术——测定高效液相色谱法（一）

时间：2023-03-25 01:45:30来源：food栏目：食品快速检测阅读：

四环素类药物残留分析技术——测定高效液相色谱法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(6)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC的灵敏度、特异性高，可用于动物血液、肌肉、肝脏、肾脏等样品中TCs残留量的分析。由于TCs易与反相硅胶柱上残留的硅醇基产生不可逆性吸附，导致色谱峰拖尾，因此通常需要在流动相中加入各种扫尾剂，如草酸、磷酸、柠檬酸、甲酸及磷酸氢二钠等，以改善峰形。目前，用于TCs的HPLC分析的主要有紫外检测器(UVD)、荧光检测器(FLD)、化学发光检测器(CLD)、电化学检测器(ECD)等。

1)紫外检测器(ultraviolet detection，UVD)

TCs有很好的紫外吸收特性，摩尔吸收系数较大。它们在酸性溶液中的紫外最大吸收波长一般在350～380nm之间，而在这个波长段附近，体液和组织内的化合物很少有吸收，因此干扰较少，可提高灵敏度。采用UVD或二极管阵列检测器(DAD/PDA)检测，其检测限可以达到ng/g或ng/mL。对不同的样品，通过选择合适的流动相，可以提高其选择性，改善色谱峰形，降低信噪比；而且分析时间一般较短(8～16min)。

Samanidou等对牛肉中MNC、OTC、TC、CTC、DC残留进行HPLC-DAD检测。以0.3mol/L柠檬酸溶液(pH4)提取样品，采用高交联度的球状聚合体吸附剂为填料的萃取柱对样品进行净化，以甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸溶液(30+30+40，v/v)为洗脱剂对5种TCs进行洗脱。在浓度为0.5～15.0μg/mL线性范围内，牛肉样品的加标回收率为98.7%～103.3%，方法的LOQ为25.0～40.0ug/kg。该实验以氨基苯甲酸为内标物加入到所测样品中，降低了因被测物性质不稳定带来的误差，结果重现性好。庞国芳等建立了HPLC-UVD法同时测定禽肉中TC、OTC、CTC和DC残留的分析方法。禽肉样品用0.1mol/L Na2EDTA-Mllivaine缓冲液提取，上清液用HLB固相萃取柱和Carbolicacid阴离子交换柱净化，用流动相洗脱定容后，用UVD于350nm测定。在5～100mg/kg添加水平，回收率为60%～100%，RSD在16%以内：TC、OTC的LOD为2mg/kg，CTC和DC的LOD为5mg/kg。Ryuji等提出了一种简化了的食用鱼和小虾中药物残留的HPLC检测方法。测定TC和OTC时，以甲醇-草酸(1+9，v/v)的混合溶液为流动相，用28%的氨水调节pH7.0，紫外检测波长360nm，在信噪比(S/N)为3时LOD为0.02ug/g。Shalaby等通过对不同方法的每一步评价，优化并验证了一种测定鸡肉和肝脏中TC残留的HPLC-DAD分析方法。该方法采用2mL 20%的三氯乙酸和柠檬酸盐缓冲液(pH4)进行UAE提取，离心后取上清液，经C18固相萃取柱净化后，用反相色谱柱(Nuclosil 100 1825cm×4.6mmid，5μm)梯度洗脱，DAD在351nm检测。结果表明，在线性范围为50～5000ng时，校准曲线线性关系良好(2大于等于0.999)；鸡肉及肝脏中的准确度分别为71.88%～92.44.3%和68.88%～84.84%，精密度均低于10%；OTC、TC、CTC和DC的LOD分别为4.4ng、5ng、13ng和10ng，LOQ分别为10ng、13ng、27ng和22ng。Yu等建立了一种简单、快速定量测定猪、鸡和牛肌肉和肝脏样品中OTC、TC、CTC、MNC、MTC、DMCT和DC的HPLC分析方法。使用ASE仪以三氯乙酸/乙腈溶液萃取HPLC-UVD检测。肌肉和肝脏中所有化合物的LOD均低于10μg/kg，LOQ不超过15ug/kg；平均回收率为75.0%～104.9%，RSD小于10%。Lee等采用HPLC方法分析韩国市场上牛肉、猪肉、鸡肉、鳗鱼、比目鱼、石斑鱼、鲷鱼、鲈鱼和牡蛎样品中的TCs等13种抗生素。经分析发现，猪肉和鳗鱼中OTC的含量分别为0.01mg/kg和0.05mg/kg。Fletouris等建立了可食性动物组织中OTC及其代谢物4-epiOTC的离子对HPLC分析方法。样品用2mol/L硫酸调pH2.7，乙腈提取，经硫酸铵溶液和0.1mol/L磷酸净化后，HPLC-UVD测定。Nucleosil 100-5 C18色谱柱分离，乙腈-0.01mol/L磷酸氢二钠(20+80，v/v，含四丁基铵和辛烷磺酸盐，pH3.8)等度洗脱，UVD在370nm测定。方法回收率超过82.6%，RSD小于6%；肌肉和脂肪中的LOQ为30ng/g，肝脏和肾脏中的LOQ为50ng/g。

张素霞等建立了牛奶中TCs残留的HPLC-UVD分析法。用MSPD技术处理样品，以甲醇乙腈-0.01mol/L草酸(2+3+5，v/v)为流动相，C18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)分离，流速为1.0mL/min，检测波长为365nm，进样体积为20μL。在0.1～0.5μg/mL添加浓度范围内，4种TCs(CTC、TC、OTC和DC)的平均回收率为78.7%～90.2%，CV在2.4%～18.8%之间，测得样品的LOD为0.02～0.05ug/mL。Kaale等采用PS/DVB为填料的反相柱检测牛奶中OTC残留。以20%(v/v)三氣乙酸沉淀蛋白，乙酸-水(pH4.5)-乙腈(4+68+28，v/v)为流动相，UVD检测波长为354nm。在100～1000ng/mL范围内呈良好线性(2-0.995)，日内RSD为0.8%，样品中OTC的LOD为30ng/mL该方法无需使用离子对试剂，结果有较高的稳定性和重现性。Furuawa建立了采用非有机溶剂测定牛奶中OTC残留的HPLC-DAD分析方法。该方法没有采用常用的C18柱或C8柱，而是用C4柱分离，TCs更不易保留，所需的流动相有机极性强度和量均减小，可采用无有机溶剂的流动相。OTC在0.1～1.0μg/mL添加浓度范围，回收率为80%～84%，RSD为4.2%～5.3%；LOQ为0.08ug/mL。Fletouris等报道了采用离子对HPLC分析羊奶中OTC残留标示物的方法。样品经酸化，用乙腈提取，硫酸铵溶液和磷酸净化后，HPLC-UVD测定。Nucleosil C18色谱柱分离，同时含有正负电荷的离子对试剂为流动相。方法回收率超过86%，RSD小于4.6%；LOD为20μgkg。Fritz等开发了同时测定牛奶中TC、4-epiTC和OTC的反相HPLC-PDA方法。牛奶经提取后用DiscoverySPE DSC-18柱净化，室温下用WatersSymmetry C18色谱柱分离，0.01mol/L草酸溶液-乙腈～甲醇(150+20+20，v/v)为流动相，整个分析小于8min。方法LOD为2.0ug/L；在添加浓度0.25ug/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和1.5ug/mL，TC、4-epiTC和OTC的平均回收率分别为91.5%、71.5%和83.1%，日内RSD小于4%，日间小于7%。

Vias等采用反相HPLC-UVD测定蜂蜜中的TCs。采用弱酸性溶液(含EDTA，以释放蛋白和糖结合态的药物)提取，苯基SPE柱净化后，HPLC-UVD测定。色谱柱键合的酰胺基固定相阻断了TCs与残留硅醇基的结合，避免了拖尾峰的出现。以乙腈和草酸为流动相梯度洗脱，所有药物分离良好。方法线性、准确度、灵敏度、精密度均满足残留分析要求，LOD在15～30ng/g之间。

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