四环素类药物残留分析技术——前处理方法（二）

时间：2023-03-25 01:52:04来源：food栏目：食品快速检测阅读：

四环素类药物残留分析技术——前处理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)净化方法

目前国内外有关生物样品中TCs残留的样品净化方法主要有固相萃取(SPE)、磁性固相萃取(MSPE)、固相微萃取(SPME)、基质固相分散(MSPD)、分子印迹技术(MIT)、限进介质(RAM)、金属螯合亲和层析(MCAC)等技术。

1)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

SPE不需要大量有机溶剂，不产生乳化现象，可净化很小体积的样品，被广泛用于分离和净化样品中的TCs。SPE柱通常选择基于反相保留机理的HLB、C18、Strata-X净化，也有采用基于阴离子交换机理的SAX、MAX等，此外还可联合用柱，以提高净化效果。

Peres等采用C18 SPE柱净化蜂蜜中的OTC、TC和CTC。3g蜂蜜中加入15mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH4.0)提取，C18 SPE柱分别用5mL甲醇和5mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液平衡，5mL样品上样通过SPE柱，2.5mL mellvaine缓冲液-甲醇(85+15，v/v)和2.5mL水洗涤，减压干燥2min，2.5mL乙腈再次洗涤，减压干燥1min，3.0mL乙酸乙酯-甲醇(75+25，v/v)洗脱，30～35℃水浴中氮气吹干，1mL甲醇-水(15+85，v/v)复溶，过滤后HPLC检测。方法的回收率为86%～111%，CV低于11%，LOD和LOQ分别为8μg/kg和25μg/kg。由于TCs容易与金属离子整合，一般采用EDTA对SPE柱进行预处理，可以有效避免TCs在SPE柱的损失，提高回收率。Suarez等采用多壁碳纳米管(MWNTs)吸附净化水样中的TCs，并与毛细管电泳-质谱(CE-MS)串联分析，方法LOD在0.30～0.69μg/L之间，回收率为98.6%～103.2%。Aoyama等报道，未经EDTA处理的C18柱由于硅胶基表明的硅烷醇基的存在及残余的金属离子易与TCs结合，而影响净化效果和回收率，将EDTA加入上样液中或预处理SPE柱，则可以获得较好效果。以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS/DVB)为填料的反相柱与烷基键合硅胶柱相比，PS/DVB填料本身具有疏水性和可再生性，不需要键合烷基链，因此不存在TCs与残余硅羟基结合产生的峰形拖尾现象。Blasco等采用HLB固相萃取柱净化牛、猪、家禽和羔羊肌肉组织中的CTC、TC、OTC和DC。方法以水为提取溶液，ASE提取，提取液经HLB固相萃取柱净化，5mL甲醇和5mL水活化，提取液过柱后，2mL甲醇-水(95+5，v/v)洗涤，2mL甲醇洗脱(10mmol/L甲酸酸化)，洗脱液吹干，1mL甲醇-水(50+50，v/v)复溶，LC-MS/MS检测。方法平均回收率高于89%，日内和日间CV分别低于15%和17%，LOQ为0.5～1.0μg/kg，CCa和CCβ分别为101～116μg/kg和112～130μg/kg。Koesukwiwat等采用HLB柱净化牛奶中的3种TCs，回收率在72.01%～97.39%之间，RSD小于11.08%。Andersen等也采用HLB柱净化虾和牛奶中的TC、OTC和CTC，回收率超过75%，RSD小于10%。Xu等则采用HLB柱净化蜂王浆中的TC、OTC、CTC和DC，方法回收率在62%～115%之间，CV为3.4%～16.3%。Wang等采用Strata-XSPE柱净化蜂蜜中的OTC、TC、CTC和DC。5g蜂蜜用15mL 0.1mol/L乙酸钠溶液(pH4.5)稀释，搅拌器1000r/min搅拌5min，过滤后过SPE柱(10mL甲醇、10mL水和10mL 0.1mol/L乙酸钠溶液平衡)，SPE柱真空干燥5min，5mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液40℃旋转蒸干，0.25mL甲醇-0.01mol/L盐酸溶液(20+80，v/v)复溶，HPLC检测。方法的回收率为95.3%～103.5%，CV低于2.79%，LOD为2.12～5.12μg/mL。

庞国芳等比较了单一固相萃取柱净化(OasisHLB)和双柱净化(HLB和Carboxylic acid阴离子交换柱)禽肉中OTC、TC、CTC、DC的效果。禽肉样品用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH4)提取，提取液以不超过3mL/min的流速通过HLB固相萃取柱，5mL甲醇-水(5+95，v/v)洗涤，减压抽干20min，15mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液在减压下以不超过3mL/min的流速通过Car-boxylicacid阴离子交换柱，5mL甲醇洗柱，减压抽干5min，4mL乙腈-甲醇-0.01mol/L草酸溶液(2+1+7，v/v)洗脱于5mL样品管中，定容至4mL，紫外检测器于350nm测定。在5～100μg/kg添加水平，方法回收率为60%～100%，RSD在16%以内；OTC、TC的LOD为2μg/kg，CTC、DC的LOD为5μg/kg。实验发现，单独使用HLB柱净化，在4.3min、4.9min、5.5min和8.2min均有比较大的干扰峰存在，当OTC、TC、CTC、DC含量小于0.010mg/kg，对检测结果均有影响，而采用HLB和Carboxylicacid阴离子交换柱双柱净化，从4min到18min之间均无干扰峰，改进了净化效果，减少了基质干扰，提高了方法的准确度。Jia等B3采用HLB和MAX柱联合净化水样中的6种TCs及其10种代谢物。经MAX净化后，LC-MS/MS色谱峰出峰范围内的干扰峰消失，方法回收率为34%～113%，LOD为0.8～17.5ng/L。

2)磁性固相萃取(magnetic solid phase extraction，MSPE)

MSPE是一种以磁性或可磁化的材料作吸附剂基质的一种固相萃取技术。在MSPE过程中，磁性吸附剂不直接填充到吸附柱中，而是被添加到样品的溶液或悬浮液中，将目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面，在外部磁场作用下就可使目标分析物与样品基质分离开来。与普通的SPE技术相比，MSPE萃取过程简单化，不需要昂贵的设备，化学物质的使用量大为减少，且没有二次污染产生。MSPE不仅能萃取溶液中的目标分析物，还能萃取悬浮液中的目标分析物，且由于样品中的杂质一般都是反磁性物质，能有效地避免杂质的干扰。因此，MSPE被人们越来越多的应用于环境、食品、生物、医药等领域中样品的分离和富集。

Rodriguez等采用MSPE方法净化牛奶中的CTC、TC、OTC，牛奶样品直接经MSPE净化，酸化甲醇洗脱。在50mL牛奶中加入0.3g硅烷化磁性SPE填料，搅拌20min使均匀分散，静置5min，用磁铁分离硅烷化磁性填料，10mL的EDTA(1mmol/L)洗涤，3×1.5mL乙酸甲醇溶液(1mmol/L)洗脱，取0.5mL洗脱液，加入0.5mL的EDTA溶液(1mmol/L)，硼酸盐缓冲剂稀释至10mL，紫外-可见分光光度计540nm检测。方法的线性范围为0.03～0.60mg/L，LOD为10μg/L，平均回收率为91.0%～97.0%，CV低于5%。

3)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME的选择性是根据“相似相溶”原理，结合被测物的极性、沸点和分配系数，通过选用具有不同涂层材料的纤维萃取头而实现的。SPME-HPLC技术已经在涂层材料和操作方式两方面获得了较大的发展，在操作方式上，除最初的手动SPME-HPLC继续获得发展外，管内SPME-HPLC(in-tube-SPME-HPLC)等新开发的操作方式也取得很快发展。

Wen等以生物相容性的聚合整体毛细管柱作为吸附媒介，利用在线管内SPME-HPLC对鱼肉中CTC、TC、OTC和DC进行分析检测。取1.0g鲫鱼肌肉样品，加入10mL 0.01mol/L的EDTA-Macllvaine缓冲液(pH4.0)，手动混合10min，4℃避光静置30min，12000r/min离心5min，上清液SPME净化，HPLC检测。在100～10000ng/g浓度范围内抗生素的线性关系良好，LOD为16～30ng/g，回收率为68.1%～75.9%，日内和日间CV分别低于4.22%和5.71%。整体毛细管由于增大了与样品溶液的接触面积，使目标物的提取效率更高，样品前处理简便快捷，无需处理鱼肉中的蛋白和脂肪。Hu等以TC为模板，合成了分子印迹聚合物(MIPs)，涂层SPME纤维，用以净化鸡肉和牛奶中的痕量TC、OTC、DC和CTC，并采用在线HPLC方法检测。方法回收率均超过71.6%，LOD在1.0～2.3μg/L之间。Tsai等报道了采用分散固相微萃取(dispersive-SPME)净化奶中TC、OTC、CTC和DC的方法。作者发现，基于硅胶的吸附剂，尤其是用伯胺、仲胺或羰基官能化的，在有机环境下，其吸附容量比聚合物吸附剂更高。用乙腈萃取，并加盐促进分配后，TCs用少量的伯胺和仲胺硅胶吸附剂吸附，解吸后用HPLC检测。方法回收率为97.1%～104.1%，LOD在7.9～35.3ng/g之间。

4)金属螯合亲和层析(metal chelate affinity chromatographic，MCAC)

MCAC是将吸附材料经CuSO4溶液处理，含有TCs的提取液经MCAC净化，TCs与结合在琼脂凝胶柱上的Cu整合而被专一性地吸附在柱填料上，再以EDTA-Mcllvaine缓冲液洗脱，达到与其他杂质分离的目的。

Stubbings等利用在线MCAC-HPLC检测动物组织中的TCs残留。25uL CuSO4溶液(50g/L)和500μL纯水活化MCAC柱，提取液以0.36mL/min流速上样，500uL纯水、500μL甲醇、500μL纯水分别洗涤，KH2PO4-EDTA-Mcllvaine缓冲液洗脱，KH2PO4-EDTA-Mcllvaine缓冲液-甲醇-乙腈和KH2PO-EDTA-Mllvaine缓冲液分别平衡以再生MCAC柱。方法检测OTC和TC的LOD为10μg/kg，检测CTC和DMCT的LOD为20μg/kg，回收率为50%～80%。Cooper等报道了采用在线MCAC-HPLC测定动物组织和鸡蛋中TCs的方法。用乙酸乙酯提取，蒸干后用甲醇复溶，在线MCAC-HPLC检测。当添加浓度为25ug/kg时，TC、OTC、CTC和DMCT的回收率在42%～101%之间，LOD优于10ug/kg。Croubels等用琥珀酸钠缓冲液和甲醇均质提取动物组织和鸡蛋样品中的TCs，离心后，MCAC净化，再经阳离子交换萃取膜富集后，HPLC检测。TCs的回收率为40%～70%，RSD小于10%；LOD在0.42～1.38ng/g之间，LOQ在2～5ng/g之间。

5)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是将样品与C18、氧化铝等吸附剂一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒表面，制成半固态后装柱，然后选择合适的洗脱剂洗脱。MSPD技术浓缩了传统样品前处理中匀浆、提取、净化等过程，避免了待测物在这些过程中的损失，具有提取净化效率高、节省溶剂、样品用量少等优点。

张素霞等建立了牛奶中CTC、TC、OTC和DC残留的MSPD提取和净化方法。称取22g C18填料，装入50mL玻璃注射器，分别用两倍柱体积的正己烷、二氯甲烷和甲醇依次洗涤，真空干燥；称取2g干燥后的C18填料置于玻璃研钵中，分别加入0.05g Na2EDTA和草酸，将0.5mL牛奶样品加至C18填料上，用玻璃杵轻轻研磨30s，使样品与填料均匀混合，取5mL玻璃注射器，下端垫一片滤纸，加无水硫酸钠至0.2mL体积，将样品装入，上垫一片滤纸，压至体积为4.2mL；用8mL正已烷洗涤，真空抽干后用乙酸乙酯-乙腈(1+3，v/v)洗脱于鸡心瓶中，加0.1mL乙二醇，用旋转蒸发仪除去溶剂，残留物用0.4mL甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸(2+3+5，v/v)溶解，涡动混合15s，转至玻璃离心管中，2000g离心10min；取上清液进样，HPLC测定。方法的平均回收率为78.7%～90.2%，CV在2.4%～1.18%之间，LOD为0.02～0.05μg/mL。Mu等分别采用硅酸镁(Florisil)、硅胶和C18作为MSPD吸附剂，建立了牛奶中TC、OTC和DC的残留方法。将吸附剂与牛奶样品按4：1混合后装入注射器，用6mL正己烷洗涤脱脂，6mL 0.1mol/L柠檬酸水溶液-甲醇(1+9，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干，0.5mL甲醇复溶，0.45um滤膜过滤，CE分析。结果显示，采用C18的回收率最高，平均回收率为93.4%～102%，LOD为0.0745～0.0808μg/mL。

6)分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)

MIT是通过化学手段人工合成的高分子仿生材料。在目标分子(模板分子)的存在下交联聚合，然后洗脱除去模板分子，在立体空穴和作用位点上与模板分子具有互补的结构，又具有模板分子可回收重复使用的优点，因此在分子识别中有着特殊的选择性。

李倩等用沉淀聚合的方法以DC为模板分子合成对TC、OTC、CTC具有特异性识别的MIPs。1mmoL盐酸强力霉素、60mL乙腈、8mmoL甲基丙烯酸(MAA)、16mmoL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和45mg偶氮二异丁腈(ABIN)混合，通氮除氧后，60℃磁力搅拌反应24h，获得MIPs。识别性能和物理特性验证表明，该MIPs对TCs有特异性吸附作用，并具有良好的稳定性。以该MIPs作为填料制备SPE小柱，净化条件为：5mL甲醇活化，10mL水溶液上样，3mL 5%甲酸水溶剂淋洗，6mL 1%甲酸-甲醇溶液洗脱。该小柱最大载样量为0.2mg，平均回收率为72.31%～90.85%，CV低于10%。Sun等以TC作为模版，MAA为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，甲醇为溶剂，环己醇和十二烷醇作为混合致孔溶剂，首次采用原位MIT技术制备了TC印迹整体柱，并对合成条件和性能进行优化和评估。该整体柱与C18 SPE柱连接，被用于牛奶和蜂蜜中TCs的净化，方法回收率在73.3%～90.6%(牛奶)和62.6%～82.3%(蜂蜜)之间。Hu等以TC为模板，丙烯酰胺为功能单体通过三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯合成MIPs，涂层SPME纤维，采用在线HPLC检测鸡肉和牛奶中的痕量TC、OTC、DC、CTC。方法回收率均超过71.6%。实验与用普通涂层得到的回收率进行了比较，结果MIPs涂层对TCs的提取效果令人满意。

7)限进介质(restricted access materials，RAM)

RAM也称为限制进入固定相，是一种新型在线样品预处理填料，同时兼具分离和富集功能，通过控制填料的孔径和对其外表面进行亲水性修饰，使得亲水性外表面与生物样品中大分子物质不发生不可逆的变性和吸附，进而在死体积或近于死体积的情况下被洗脱除去。具有避免被分析物由于前处理所造成的损失，减少传统生物样品制备时的繁琐步骤，节省人力和物力且易于实现自动化等优点。Chico等将二醇基键合在多孔硅胶孔外表面，Cs烷基链键合在内表面作限进介质材料，在线RAM-HPLC检测牛奶中TCs。以Mg(NO3)2·6H2O作为柱后衍生试剂，测得牛奶的CV为6%～9.2%；方法提高了分析物的可检测性，但所测OTC、TC的回收率仅为50%和67%。

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