喹噁啉类药物残留分析技术——提取方法

时间：2023-03-25 00:35:00来源：food栏目：食品快速检测阅读：

喹噁啉类药物残留分析技术——提取方法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

喹噁啉类残留分析对象主要包括药物原形及其代谢产物。此外，动物组织中喹噁啉类药物经过机体代谢，在动物体内N1和N4位脱氧，也常检测脱一氧和脱二氧中间代谢产物。中间代谢物进一步代谢为QCA或MQCA，QCA和MQCA在动物体内消除缓慢，分别规定为CBX和OLQ的残留标示物。各代谢物化学结构式见图15-1 和图15-2。这两种残留标示物均呈现酸性特征，常利用这一特征进行残留分析。国内研制的CYX、QCT和MQX等产品，残留标示物还有待确定。

15.1.4.1 前处理方法

(1)提取方法

喹噁啉类药物不宜在高温高压下进行提取，目前主要采用传统的液液萃取方法(liquidliquid extraction，LLE)来提取动物源基质中的该类药物。本类药物中的CBX、OLQ等原形药物及其脱一氧和脱：二氧对应的脱氧代谢物不与组织结合，直接提取即可。但在动物体内，CBX残留标示物为QCA，CYX也代谢为QCA；OLQ残留标示物为MQCA，MQX、QCT也代谢为MQCA。QCA和MQCA为有机酸，极性较强，在动物体内通过共价键与一些氨基酸或蛋白质结合，以结合态存在，需要利用酶水解或化学水解方法使之先被释放出来再进行提取。

1)直接提取

药物原形以及中间脱氧代谢物不与组织结合，直接提取即可。

Huang等测定鸡血液、肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中CYX及其代谢物BDCYX。血浆用等体积甲醇涡动萃取2 min；其他组织，2g样品先加入1 mL水，涡动混合1 min后，脂肪样品用甲醇-乙腈(1+1，v/v)提取，其他样品用乙酸乙酯提取，第一次4mL，然后依次为2×2mL提取，涡动混合后，超声提取5min，低温离心取有机溶剂层，净化后用高效液相色谱(HPLC)测定。CYX和BDCYX的定量限(LOQ)为0.025mg/kg(血浆和组织)；方法回收率在73%～87%之间，日间相对标准偏差(RSD)小于9.86%。Zhang等提取羊组织中CYX及其代谢物BDCYX。5g肌肉、肝脏、肾脏加入2mL水、10mL乙酸乙酯匀浆，脂肪组织加入10mL乙腈匀浆，重复提取一次，取2次提取上清液蒸干，残留物用乙腈-正己烷液液分配净化，乙腈层蒸干用甲醇复溶后HPLC测定。CYX的回收率在65%～79%之间，日间变异系数(CV)为6.7%～11.1%；BDCYX的回收率为70%～92%，日间CV为4.7%～15.9%；方法检测限(LOD)为15μg/kg，LOQ为25ug/kg。He等用乙腈直接提取血液中的CYX代谢物QCA、BDCYX、1-脱氧喹赛多和4-脱氧喹赛多。HPLC测定的检测限(CCa)为1.0～4.0μg/L，检测能力(CCβ)小于10μg/L，回收率为87.4%～93.9%，CV小于10%。

Aerts等采用甲醇-乙腈直接提取猪组织中CBX及其代谢物1-脱氧卡巴氧、4～脱氧卡巴氧和BDCBX。10g匀浆样品(肌肉、肝脏、肾脏)中加入40mL甲醇-乙腈(1+1，v/v)，振荡混合15min，2000g离心5min，取上清液进一步净化。HPLC测定的LOD为0.5～1μg/kg(CBX)、2～3μg/kg(BDCBX)、1～2μg/kg(1-脱氧卡巴氧和4-脱氧卡巴氧)，平均回收率为81%～87%，CV为4%～10%。我国国家标准GB/T20746-2006测定牛、猪肝脏和肌肉中CBX残留。5g试样中加入5g中性氧化铝，25mL乙腈-乙酸乙酯(1+1，v/v)混合5min提取，离心取上清液，进一步净化，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，LOD为0.5μg/kg，回收率为79%～90%。

Huang等测定猪、鸡组织中QCT及其代谢物BDQCT，5g肌肉/肝脏加2mL水，15mL乙酸乙酯；5g脂肪加15mL甲醇-乙腈(1+1，v/v)，振荡1min，超声1min，离心取.上清液蒸干，残留物用乙腈异辛烷溶解和液液分配，蒸千乙腈层，复溶后进HPLC测定。LOD和LOQ分别为0.025mg/kg；和0.05mg/kg；猪组织中QCT回收率为69%～85%，CV为3.8%～11.2%；BDQCT回收率为71%～81%，CV为6.9%～11.2%。鸡组织中QCT回收率为67%～82%，CV为9.2%～11.9%；BDQCT回收率为65%～79%，CV为7.7%～10.3%。

Zhang等测定猪尿中MQX及其4种代谢物：1-脱氧乙酰甲喹、4-脱氧乙酰甲喹、BDMQX和MQCA。5mL样品中加200μL甲醇和60μL四氯乙烷，超声波萃取4min，离心后HPLC测定。方法LOD为0.16～0.28μg/L，回收率为72.0%～91.3%，CV小于5.2%。

2) 水解后提取

A. 碱解后提取

用碱解方法断裂QCA或MQCA与蛋白质等结合酰胺键，碱性水解液一般用酸中和后，再用有机溶剂萃取，最常用的是乙酸乙酯。在水解过程中，动物组织中部分蛋白质也被水解产生小分子氨基酸和多肽，需要净化水解的干扰物。

Huang等测定猪和鸡组织中QCT代谢物MQCA，样品采用3mol/L氢氧化钠在95～100℃碱水解30～40min，然后用浓盐酸中和，再用乙酸乙酯振摇2min萃取，取乙酸乙酯提取液进一步净化后用HPLC测定。LOQ为0.05mg/kg，LOD为0.025mg/kg，回收率为74%～84%，CV为4.5%～10.8%。

Huang等用3mol/L氢氧化钠溶液在100℃，维持30min，水解鸡血液和组织中CYX代谢物QCA，水解液用盐酸中和，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液中的QCA再反萃取至柠檬酸缓冲液，经过阳离子交换柱净化后，再用稀盐酸与三氯甲烷液液分配净化，HPLC检测。QCA的LOQ为0.025mg/kg(血浆和内脏组织)和0.02mg/kg(肌肉)；回收率为70%～87%，日间RSD为7.69%～1.43%。Zhang；等测定羊组织中CYX代谢物QCA，5g样品加入10mL 3mol/L氢氧化钠溶液，100℃碱解30min，冷却至室温，加入4mL浓盐酸混匀中和，离心，取上清解离液进一步净化后，采用HPLC测定。QCA的回收率为70%～82%，日间CV为6.6%-11.1%；LOQ为25μg/kg，LOD为15μg/kg。Hutchinson等测定猪肝脏中CBX代谢物QCA，5g组织加入3mol/L氢氧化钠溶液10mL，在100℃水解样品30min，解离与组织结合的QCA，水解液用4mL浓盐酸充分中和，用乙酸乙酯提取，提取液经液液分配和固相萃取净化后，再用LC-MS/MS测定。方法回收率为89%～109%，CV为0.15%～10%，CCa和CCβ分别为0.16 ug/kg和0.27 μg/kg。

B.酸解后提取

用氢氧化钠溶液水解血液和组织中QCA和MQCA，需要在90～100℃高温进行，动物组织中部分蛋白质也会发生分解，产生较多的小分子氨基酸，增加了样品测定的干扰，影响检测。酸性条件下水解主要采用稀酸或稀酸有机溶剂混合液来水解，加热温度较低，水解产生的游离基质成分较少，酸水解较为彻底，减少MQCA和QCA的降解损失，并有效释放结合态的MQCA和QCA，效果优于碱性水解。药物水解后转移至酸性水解液，提取时将水解液离心，直接取上清液净化即可，这样水解和提取同步进行。最常用的酸有盐酸和偏磷酸。

Zhang等建立了鱼、对虾体内OLQ代谢标志物MQCA的残留测定方法。5g样品加入15mL2mol/L盐酸溶液，涡动混合2min，盖塞于60℃振荡酸解1h，然后8000g离心10min，收集酸解上清液，经MAX小柱净化后，LC-MS/MS测定。LOD和LOQ分别为0.1ng/g和0.25ng/g，在添加0.25～50.0ng/g水平范围内，平均回收率为92.7%～104.3%，RSD小于6%。吕海鸾等133采用0.2mol/L盐酸于60℃振荡1h，水解和提取猪肉、猪肝、猪肾、胖头鱼、对虾和蟹组织中OLQ的残留标示物MQCA，提取上清液直接用C18固相萃取柱净化，LC-MS/MS测定。猪肉、猪肝、猪肾、鱼、对虾和蟹中MQCA的LOD依次为0.90μg/kg、1.51μg/kg、0.94μg/kg、1.04μg/kg、1.62μg/kg和1.80μg/kg，LOQ依次为3.00μg/kg、5.02μg/kg、3.13μg/kg、3.46μg/kg、5.40μg/kg、6.00μg/kg；MQCA的平均回收率均在73.6%～89.0%之间，日内RSD在15%以下，日间RSD为20%以下。梅景良等建立了鲤鱼、对虾中OLQ及其代谢物MQCA的残留分析方法。取2.5g组织加入7mL 0.3mol/L的HCI溶液，振荡提取2min，离心转移上清液，残渣再用6mL 0.3mol/L的HCI溶液提取一次，C18固相萃取柱净化，氮气吹干并用流动相定容后，HPLC测定。当OLQ及MQCA在鱼组织中的添加水平分别为20～200μg/kg和35～200μg/kg时，平均回收率分别为83.5%～87.7%和79.6%～87.4%；当OLQ及MQCA在虾组织中的添加水平分别为15～200μg/kg和30～200μg/kg时，平均回收率相应为74.6%～80.9%和81.0%～86.6%；两种组织中两种化合物的批内RSD为0.51%～4.47%，批间RSD为0.66%～7.58%；鲤鱼组织中OLQ和MQCA的LOD分别为6ug/kg和10ug/kg，LOQ分别为20μg/kg和35μg/kg；对

虾组织中OLQ和MQCA的LOD分别为4.5μg/kg和8μg/kg，LOQ分别为15μg/kg和30ug/kg。

Yong等建立了鸡组织中QCT代谢物MQCA的测定方法，2g样品先在氯仿-乙腈(1+2，v/v)超声波提取2次，每次超声提取10min，离心后转移两次的提取上清液，组织中再加入1mol/L盐酸，在90s℃水解1h，解离与组织结合的药物残留，放置室温后，加入10mL氯仿-乙腈(1+2，v/v)超声波提取5min，离心，取有机层蒸干，经进一步净化后，LC-MS/MS测定。方法回收率为77.1%～95.2%，CV小于15%；CCa为0.24～0.76μg/kg，CCβ小于2.34μg/kg。

采用偏磷酸水解避免了强酸和强碱的使用，水解液直接用有机溶剂萃取，可简化操作。同时，偏磷酸还可有效沉淀组织蛋白，干扰明显少于碱水解方法。

Horie等用0.3%偏磷酸甲醇(7+3，v/v)同时解离和提取猪肌肉和肝脏中CBX及其代谢物QCA和BDCBX，涡旋混匀，振荡提取10min，离心，上清液经HLB固相萃取柱净化后，LC-MS/MS测定。在添加浓度为2.5ng/g和5ng/g时，QCA和BDCBX的回收率为70.2%～86.3%，LOD均为1ng/g。Xu等测定猪肝中CYX代谢物QCA，用偏磷酸～甲醇-水(2+20+78，v/v)提取，LC-MS/MS测定回收率仅为40%，原因是偏磷酸脱蛋白不彻底，QCA重吸附导致回收率低下；而改用5%偏磷酸-甲醇(8+2，v/v)提取，回收率增加到70%。Della等测定猪肝中QCA，样品中加入偏磷酸-甲醇-水(2+20+78，v/v)溶液，涡动混合提取1min，离心取上清，净化后气相色谱-质谱(GC-MS)测定。方法回收率为90%～102%，CV为1.7%～8.4%，CCa和CCβ分别为32μg/kg和34ug/kg，LOD为0.2μg/kg，LOQ为0.7μg/kg。

Sniegocki等测定猪肌肉中CBX及其代谢物BDCBX、QCA和OLQ及其代谢物MQCA，5g样品匀浆，加入6mL 2%偏磷酸-20%甲醇-水溶液，混匀后超声15min提取，然后低温离心，取上清液进一步净化，LC-MS/MS测定。方法CCa为1.04～2.11ug/kg，CCβ为1.46～2.89ug/kg，回收率范围为99.8%～101.2%。Wu等提取动物组织、鱼肉中的QCA和MQCA，加入5%偏磷酸-10%甲醇溶液涡动混合提取2min，离心，取上清，再重复提取一次，合并两次提取液，再进一步净化，HPLC测定。MQCA和QCA的CC。为0.7～2.6μg/kg，CCβ为1.3～5.6ug/kg，回收率为70%～110%，RSD小于20%。研究发现，提取溶剂中加入适量甲醇可提高药物的溶解性，但甲醇含量超过10%时，回收率反而低于60%，原因可能是甲醇含量过高影响了蛋白沉淀，降低了偏磷酸的溶解度和影响了组织蛋白对药物的释放，从而降低提取回收率。实验证明5%偏磷酸10%甲醇溶液为最佳。

C.酶解后提取

酶解的方法比酸/碱水解具有更多优点，可以选择性破坏药物与组织结合键，减少样品基质共提物，但是耗时较长，一般要在16h以上。酶解前，可用甲酸消化和灭活基体的组织活性酶，提高酶解效率。酶解后的样品再用酸性溶剂提取，提取的同时也起到脱蛋白的作用。

Hutchinson等测定猪肝中OLQ和CBX的代谢物MQCA和QCA，5g均浆样品中加入8mL0.2mol/L Tris/HCl缓冲液(pH9.6)和50μL蛋白酶(protease type XIV，50mg/mL)，混匀后于55℃过夜酶解，蛋白酶解液放置室温后加入1mL浓盐酸酸化提取，混匀，离心，获得.上清液，经净化后，LC-MS/MS测定。QCA的CCa和CCβ分别为0.4μg/kg和1.2μg/kg，MQCA为0.7μg/kg和3.6μg/kg。Merou等测定猪、牛肌肉和猪肝中QCA和MQCA，5g样品中加入QCA-d4内标，10mL 0.1mol/L Tris缓冲液(pH9.5，含5mg枯草杆菌蛋白酶A)，在52℃孵育2h酶解，酶解上清经固相萃取柱净化后，LC-MS/MS测定。CBX、MQCA、QCA的CCa和CCβ范围分别为0.09～0.24μg/kg和0.12～0.41μg/kg，回收率为92%～101%(MQCA、QCA)和60%～62%(CBX)，CV小于12%。林黎等建立了牛奶和奶粉中CBX和OLQ代谢物QCA和MQCA残留量的LC-MS/MS法。5g牛奶样品加入10mL 0.6%甲酸溶液，混匀后于47℃振摇1h，然后加入3mL 1.0mol/L Tris溶液和0.3mL蛋白酶水溶液，充分混匀，47℃酶解16～18h，酶解后的样品溶液加入20mL 0.3mol/LHCI，振荡混匀后离心15min，上清液过滤，经固相萃取柱净化后测定。牛奶中QCA和MQCA的LOQ为0.5 μg/kg，奶粉为4.0 μg/kg；平均回收率为68.2%～82.5%，CV为3.4%～ 12%。刘正才等测定动物源食品中OLQ代谢残留标识物MQCA残留，5g均质组织样品加入8mL蛋白复合体消化溶液(0.2 mol/L Tris缓冲盐溶液含0.1mol/L氯化钙，HCI溶液调pH9.6)，混匀，再加入0.3mL 10g/L蛋白酶溶液，充分混匀后，47℃摇床酶解16～18h，酶解液经固相萃取净化后，LC-MS/MS测定。样品中MQCA的LOQ为0.3～0.5μg/kg，平均回收率在60.7%～107%之间，RSD在4.59%～14.9%之间。

Boison等采用0.6%甲酸于47℃，水浴1 h，消化和灭活猪肌肉和肝脏中活性酶，然后加1 mol/L Tris溶液中和，再加入1 mL蛋白酶于47℃酶解16～18 h，然后加0.3 mol/L盐酸高速振摇5 min提取，离心取上清液进一步固相萃取净化，LC-MS/MS 测定。BDCBX和QCA的LOQ分别为0.05 μg/kg和0.5 μg/kg， LOD 分别为0.025 μg/kg和0.3 μgkg，回收率在80%～120%之间。我国国标GB/T 22984-2008测定牛奶和奶粉中CBX和OLQ代谢物残留量，5g样品加入10 mL 0.6%甲酸溶液混匀后于：47℃振荡1h，加入3mL 1 mol/L Tris溶液，再加入0.01 g/mL SIGMA P5147蛋白酶0.3 mL，混匀后于47℃振荡酶解16～18h。酶解后，采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH 4)直接均质提取， LC-MS/MS测定。MQCA和QCA的回收率为75%～ 88%，LOD为0.5μg/kg (牛奶)和4μg/kg (奶

粉)。研究发现，温度和pH对酶的生物活性影响极大，蛋白酶在pH 8.5、47℃时活性最强。酶解之前，先在样品中加0.6% (体积分数)的甲酸溶液，置于47℃空气浴中1h，可使牛奶和奶粉中天然存在的其他类型酶失活，然后再用Tris 缓冲溶液调节pH，加入蛋白酶酶解。实验表明，与用甲酸水解，乙腈-水(1+1， v/v) 提取相比较，该方法效果更好，不仅反应条件温和，且酶解后药物与奶制品分离更为彻底。

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