β-内酰胺类药物最大允许残留限量

时间：2023-03-25 07:28:50来源：food栏目：食品快速检测阅读：

β-内酰胺类药物最大允许残留限量

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

5.1.3最大允许残留限量：

β-内酰胺类药物是一类非常重要的抗菌药物，在人医和兽医上应用十分广泛。由于过敏反应和细菌耐药性等原因，许多国家都对该类药物在动物上的使用以及在动物源食品中的残留进行了严格的监控。欧盟、美国、日本等国家和地区都制定了牛奶、肌肉和肾脏等动物源食品中该类药物的最大允许残留限量(maximum residue limit，MRL)，我国农业部235号公告也对其MRL做了严格规定。世界主要国家和地区规定的β-内酰胺类药物的MRLs见表5-3。

5.1.4残留分析技术

5.1.4.1前处理方法

(1)提取方法

β-内酰胺类药物属于酸性、极性化合物，目前报道的提取方法主要为液液萃取(LLE)，常用的提取溶液主要有水、有机溶剂、酸性缓冲溶液以及混合溶液(水、酸和有机溶剂中的两种或三种以一定比例混合配制)等。为了防止该类药物与动物组织中的大分子化合物形成共价键，样品提取后要进行蛋白沉淀，常用的脱蛋白试剂有甲醇、乙腈、2-丙醇、硫酸、钨酸钠、酸化乙腈(pH4.0～4.4)等，以达到同时去除蛋白质和萃取β-内酰胺类药物的目的。但是青霉素G、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等药物不耐酸，在酸性条件下易分解，因此提取液中加入酸性溶液时，应防止该类β-内酰胺类化合物发生水解。

1)水提取

我国国家标准GB/T 18932.25-2005建立了检测蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氰青霉素残留量的测定方法。样品加入去离子水进行提取，经液体混匀器进行快速混合，完全溶解样品。然后经HLB固相萃取柱进行净化，甲醇洗脱，收集洗脱液氮气吹干，乙腈复溶后，进行液相色谱-质谱(LC-MS)测定。该方法测得6种PENs药物的平均回收率为86.1%～94.3%；青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素的检出限(LOD)为1.0ug/kg，邻氯青霉素、双氯青霉素的LOD为2.0μg/kg，乙氧萘青霉素的LOD为0.5μg/kg。Goto等采用电喷雾电离(ESI)质谱选择性反应监测(SRM)模式高通量分析动物组织(牛和猪肌肉、肝脏和肾脏)中的PENs残留。取5g样品加入5mL超纯水后，经高速混匀器混合，离心后经超滤器进行净化，超滤器经1%吐温-20和超纯水冲洗，然后离心收集超滤液(13000r/min，20℃，30min)，超滤液直接进行分析。药物在0.05、1ppm添加浓度水平回收率为70%～115%，变异系数(CV)为0.7%～14.8%，LOD为0.002ppm。

表5-3 主要国家和地区规定的β-内酰胺类药物的MRLs

2)酸性溶液提取

赵军等建立了--种在同一个色谱体系下同时测定生物样品中头孢拉定、头孢氨苄、头孢克洛、氨苄青霉素、阿莫西林等5种β-内酰胺类抗生素的高效液相色谱(HPLC)方法。血清样品按1：1(体积比)加入6%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，然后离心取上清液定容后，进样分析。尿样以1：100(体积比)稀释后直接进HPLC分析。5种抗生素可在20min内分离；LOD可达到0.12～0.35ug/mL；在血清中的回收率均大于94.6%，在尿样中的回收率大于88.3%。罗道栩等采用75%的三氯乙酸溶液沉淀牛奶中的蛋白质，并提取氨苄青霉素残留，在酸性条件下，提取液中的氨苄青霉素与甲醛加热生产2-羟基-3-苯基-6-甲基吡嗪(氨苄青霉素荧光衍生物)，用带有荧光检测器(FLD)的HPLC在激发波长346nm，发射波长420nm条件下测定该衍生物，外标法定量。方法LOD为1ug/L，定量限(LOQ)为2μg/L，回收率为70%～110%，批内CV小于10%，批间CV小于15%。Santos等建立了一种检测牛奶中6种抗生素(包括氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、青霉素)残留的毛细管电泳(CE)方法。牛奶样品用20%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，混合液涡动混匀，4000r/min离心10min，收集上清液，0.4um滤膜过滤，C18固相萃取柱净化以后，进行CE分离。6种抗生素在2.5ug/mL、5μg/mL添加浓度水平平均回收率大于72%，相对标准偏差(RSD)小于5%。

Ang等采用HPLC-FLD检测鲶鱼和鲑鱼组织中阿莫西林残留。样品先用磷酸缓冲液(pH4.5)提取，然后用三氯乙酸溶液沉淀鲶鱼和鲑鱼中的蛋白质，C18固相萃取柱净化后，液液分配除去非极性干扰物。提取液与甲醇和三氯乙酸在100℃反应30min，荧光衍生物经醚提取，浓缩，HPLC检测。鯰鱼组织中阿莫西林在2.5～20ppb添加浓度范围内平均回收率大于80%，鲑鱼组织中阿莫西林平均回收率大于75%，CV小于6%；鲶鱼组织中阿莫西林的LOD和LOQ分别为0.5ppb、1.2ppb；鲑鱼组织中的LOD和LOQ分别为0.8ppb、2.0ppb。Boison等建立了一种改进的方法检测动物组织中青霉素G残留。组织样品用水提取，提取液用钨酸钠、硫酸沉淀蛋白，然后经C18固相萃取柱净化。青霉素V和苄青霉素用1mL 60%乙腈-35%水-5% 0.2moL/L磷酸盐缓冲液洗脱，加入1mL 1，2，4三唑氯化汞溶液进行衍生化，65℃反应30min。该方法对萃取牛奶中的青霉素效果非常好，使用该方法，样品中的蛋白质通常会变性，留在液液界面。该方法测得肝脏、肾脏和肌肉组织中青霉素G的LOD为5Hg/kg。

3)有机溶剂提取

黄百芬等建立了一种用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)快速测定牛奶中6种PENs残留的方法。吸取5mL牛奶样品于50mL离心管中，摇匀，加入5mL乙腈，涡流混合60s，再加入10mL乙腈涡流，1800r/min离心5min，取10mL上清液，用氮气吹干，加入3mL磷酸盐缓冲液(pH4.5)，涡流15s，经HLB柱净化和0.3um微孔滤膜过滤后，用LC-MS/MS测定。6种PENs的LOD为0.02～0.19ng/mL；在0.2～2.0ng/mL线性范围内，相关系数为0.991，回收率大于90%，方法精密度为4.87%。

4)混合溶液提取

Mastovska等以乙腈-水(4+1，v/v)提取牛肾脏中β-内酰胺类抗生素，再用C18柱进行固相萃取净化，建立了11种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、头孢唑林、头孢氨苄、氯唑西林、头孢噻呋DCCD、脱乙酰头孢匹林、双氯青霉素、乙氧萘青霉素、苯唑西林、青霉素G)的LC-MS/MS检测方法。除头孢噻呋DCCD平均回收率为60%外，其他β-内酰胺类抗生素的平均回收率为87%～103%。Lihl等采用乙腈-0.1moL/L磷酸盐溶液(4+1，v/v)提取牛肌肉组织中青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林和双氯西林，再用二氯甲烷液液分配净化，经过自动固相萃取净化后，用HPLC-光化学降解-电化学检测器(ECD)检测。该方法测得PENs的平均回收率为60%～103%，CV为6%～11%。

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