β-内酰胺类药物残留分析技术——净化方法（一）

时间：2023-03-25 07:26:28来源：food栏目：食品快速检测阅读：

β-内酰胺类药物残留分析技术——净化方法（一）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

(2)净化方法

目前文献报道动物组织中β-内酰胺类药物的净化方法主要有:液液分配(LLP)、固相萃取(SPE)和基质固相分散技术(MSPD)等。

1)液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

在早期的样品净化方法中，主要应用LLP实现样品的净化。样品经过提取后含有较多杂质，初提液不能直接进行仪器分析，需要再进行一步净化除去干扰物质。对于有机酸类β-内酰胺类药物，酸化后其结构中的羧基电离被抑制，使药物呈中性，可通过LLP对其进行有效的净化。Meetsehen等测定了动物源性食品中7种PENs残留，经乙醚-二氯甲烷LLP净化后，回收率在41%～92%之间。

Lihl等检测牛肌肉组织中5种青霉素，采用乙腈-磷酸盐溶液提取，二氯甲烷LLP净化。但这种方法不适用于两性β-内酰胺类药物提取，尤其是青霉素G，因此在LLP中，酸化后立即加入二氯甲烷或氯仿提取，避免因时间过长而药物分解。该方法测得PENs的平均回收率为60%～103%，CV为6%～11%。LLP存在操作费时、需要溶剂量大、实验结果重复性差、易产生乳化现象等问题，在β-内酰胺类药物残留分析中的应用越来越少。

2)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

SPE不需要大量的有机溶剂，不易产生乳化现象，不仅更有效，而且更容易实现自动、快速萃取动物源食品中残留的痕量药物。Marazuela等综述了动物源食品中β-内酰胺类兽药残留检测的前处理技术，将SPE列为最有效的净化手段。在β-内酰胺类药物的SPE净化中，主要采用反相填料，如C18 [6.16.28]、HLB [8.1.22.29]等。

A.HLB柱

在反相SPE净化时，上样溶液中的有机溶剂可能会增加淋洗强度，不利于目标化合物的保留，因此需先浓缩去除有机溶剂，再进行SPE净化。

Becker等D用乙腈-水提取牛奶、牛肉和牛肾脏中15种β-内酰胺类抗生素，旋转蒸发去除有机溶剂，pH8.5的磷酸盐缓冲液复溶后，用以亲水-亲脂平衡材料(二乙烯基苯-co-N-乙烯基吡咯烷酮聚合物)为吸附基质的Oasis HLB柱净化，乙腈-水(1+1，v/v)为洗脱液，回收率为71%～116%。Sorensen等建立了一种同时检测肌肉、肝脏和肾脏组织中7种PENs的多残留检测方法。样品经硫酸和钨酸钠沉淀蛋白后，经磷酸盐缓冲液提取，采用Oasis HLB柱净化。HLB柱用2mL甲醇、2mL水活化，上样后，用2mL 25mmoL/L磷酸盐缓冲液(pH9.0)淋洗，抽干后，用4mL乙腈洗脱。接着采用乙醚进行LLP净化。净化液采用苯甲酸酐和1，2，4-三唑汞试剂进行衍生化后，HPLC-紫外检测器(UVD)分析。该方法测得阿莫西林、青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林的LOD为8.9～11.1μg/kg，双氯西林为18.3～29.9ug/kg；平均回收率在58%～82%之间。白国涛等30]测定牛肉中9种CEPs药物残留时，采用Oasis HLB净化，乙腈-水(7+3，v/v)洗脱，回收率为74%～119%。张琦等建立了牛奶中阿莫西林、头孢氨苄、氨苄西林和青霉素V的检测方法。试验分别比较了Oasis HLB柱、C18柱、OasisMAX柱的回收率，结果表明HLB柱回收率最高，除了阿莫西林外，其余3种抗生素的平均回收率均高于70%。

B. C18柱

CisSPE柱也广泛用于β-内酰胺类药物残留检测。

Terada等使用Sep-PakC18柱净化海产品中的青霉素G。Sep-PakC18柱首先用20mL甲醇、20mL水、2mL 2%氯化钠溶液预洗，提取液以2mL/min的速度过柱，然后依次用10mL 2%氯化钠溶液和10mL甲醇-水-20%氯化钠溶液(3+15+2，v/v)淋洗，最后青霉素G用19mL水洗脱。在牛肝脏、肾脏、肌肉中添加1μg/g浓度的回收率为75.0%～92.6%，RSD为2.35%～4.06%，LOD为0.05μg/g。Bioson等用BondElut C18柱代替Sep-PakC18柱，在研究中发现，Sep-PakC18柱填料的碳含量小于14%，而BondElut C18柱的碳含量为18%。实验结果表明，为了从SPE柱中得到大于70%的回收率，C18柱填充料的碳含量至少应为17%。因此，在使用SPE净化的方法中，要使药物的损失最小，必须考虑SPE柱的碳含量。此外，缓冲溶液的浓度、种类以及洗脱溶液的用量等因素都会对回收率有影响。实验表明，当磷酸盐的浓度低于0.07moL/L时，回收率也随之降低，特别是两性β-内酰胺类药物，更需一定的缓冲溶液，使其保留在SPE柱上；同时，为防止磷酸盐缓冲液进入洗脱液阻塞色谱柱，洗脱前要先用水淋洗。

C.阴离子交换柱

阴离子交换SPE柱能有效地保留有机弱酸类β-内酰胺类药物。

Meetsehen等采用气相色谱(GC)方法测定动物源食品(牛肉、牛肝脏、牛肾脏、脂肪组织和牛奶)中7种PENs的残留。样品用乙腈在酸性条件下提取，然后加入氯化钠和二氯甲烷进行LLP净化，接着用阴离子交换柱净化。上样后，经0.1%磷酸溶液淋洗，乙腈洗脱。该方法测得动物源食品中7种PENs的平均回收率为50%～80%，LOD小于3μg/kg。Preu等建立了牛肉中青霉素的GC方法。样品经乙腈和磷酸盐缓冲液(pH 2.2)提取，多种溶剂对LLP净化后，再采用阴离子交换柱进行净化，净化液氮吹蒸干后，加入100μL重氮甲烷进行衍生化，使用GC-氮磷检测器(NPD)或气相色谱-质谱(GC-MS)进行检测。该方法测得青霉素的LOD为3μg/kg。

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