β-内酰胺类药物残留分析技术——净化方法（二）

时间：2023-03-25 07:24:38来源：food栏目：食品快速检测阅读：

β-内酰胺类药物残留分析技术——净化方法（二）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

3)基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

MSPD 是一种快速样品处理技术。其基本操作是把样品直接与适量的反相键合硅胶一起混合研磨，使样品被均匀分散于固定相颗粒表面制成半固态，装入层析柱中，然后采用类似SPE的操作进行洗涤和洗脱。MSPD技术使用样品量少，要求检测方法具有较高的灵敏度。Karageorgou等用Strata-X做吸附剂，MSPD法提取牛奶中5种PENs药物。Strata-X吸附剂经2mL甲醇和2mL水活化，加入牛奶样品进行混合，超声波水浴中超声10min进行匀质，随后样品转移至一个空的贮存器进行压缩，真空干燥吸附剂。接着加入5mL水(含1%丙酮)淋洗吸附剂，分析物分别用1mL甲醇、1mL乙腈洗脱，蒸干，再用Oasis HLB柱净化，HPLC检测。方法检测限(CCa)为35.2～56.3μg/kg，检测能力(CCβ)为39.9～61.9μg/kg；RSD小于16%。

4)分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)

分散固相萃取是美国农业部于2003年提出使用的一-种新的样品前处理技术。该技术是选择对不同种类药物都具有良好溶解性能的溶液作为提取剂，净化吸附剂直接分散于待净化的提取液中，吸附基质中的干扰成分。该方法回收率高，前处理时间短，溶剂使用量少，操作简便，具有很好的发展前景和推广价值。Mastovska等测定牛肾脏中11种β-内酰胺类抗生素，取1g样品至50mL离心管中，加入2mL水和8mL乙腈进行提取，涡动混匀，剧烈晃动5min，离心收集上清液。然后在上清液中加入500mg C18吸附剂，涡动混匀，晃动30s，离心。取5mL上清液转移至带刻度的试管中，旋蒸至体积小于1mL，用水定容至1mL，滤膜过滤后进LC-MS分析。除头孢噻呋代谢物(去呋喃甲酰基头孢噻呋)回收率低外，其他化合物的回收率均在87%～103%之间。

5)QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)

QuEChERS是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。原理与HPLC和SPE相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。Karageorgou等采用基于超声辅助MSPD方法，开发出QuEChERS技术提取与净化牛奶中的阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、双氯西林和氯唑西林。用乙腈提取后，200mgStrata-X、150mg MgSO4、50mg PSA、50mg C18作为QuEChERS净化剂，采用HPLC进行检测。方法的日内精密度低于16%，5种药物的CCa为35.2～56.3μg/kg，CCβ为39.9～61.9μg/kg，满足欧盟法规2002/657/EC要求。Perez-Burgos等建立了一种LC-MS/MS同时检测牛肉中7种CEPs残留的QuEChERS方法。样品经乙腈-水(80+20，v/v)提取后，采用QuEChERS方法进行净化。将10mL样品提取液加入含有150mg PSA、150mg C18吸附剂和900mg MgSO4的试剂盒。然后轻轻晃动5min，3500r/min离心5min收集上清液。取5mL上清液氮气吹干，200μL水复溶后上样分析。结果显示，采用传统SPE方法的LOQ稍低(0.1～10μg/kg)，两种净化方法的LOQ均低于MRLs，但QuEChERS方法精密度高于SPE方法，两种方法均获得较好的回收率，除头孢氨苄外，其他药物回收率均高于85%。

6)分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)

MIT以待测物为模板分子，通过共价键结合或非共价键结合聚合物单体，然后将聚合物单体交联，再将模板分子从聚合物中提取出来，聚合物内部就留下了模板分子的印迹，成为能选择性吸附待测物的功能高分子材料-分子印迹聚合物(MIP)。Cederfur等合成了以青霉素G为模板的高选择性MIP填料。称取1mmoL/L青霉素G至硼硅玻璃管中，加入乙腈超声溶解，加入甲基丙烯酸溶解青霉素G，预聚合反应混合物放在冰上进行冷却，氮吹10min。然后在Rayonet光化学反应器中，在350nm、4℃下共聚反应24h，反应结束后进行离心，收集大小为25～50μm的聚合物。将颗粒物分别用甲醇-乙酸(1+4，v/v)、甲醇、乙腈和甲醇进行孵育，然后真空干燥颗粒物。制备MIP后，合成聚合物文库，然后从文库中筛选与青霉素G结合的聚合物，对MIP进行放射性配体竞争结合试验。研究发现，该MIP填料与其他几种PENs交叉反应率小于19%，蔡夫西林和苯唑西林交叉反应率小于1%，与头孢匹林和其他结构不相关的抗生素(氯霉素、四环素、氨苯砜和红霉素)的交叉反应率低于0.01%。Zhang等甲基丙烯酸作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯做交联剂，偶氮二异丁腈作为引发剂合成青霉素G的MIP填料，净化牛奶中青霉素G。牛奶经乳酸杆菌发酵形成酸奶，取10mL牛奶加入10mg MIP，混匀5min进行提取，分离青霉素GMIP后，牛奶继续进行发酵。该方法测得青霉素G的灵敏度达10μg/kg。

7)免疫亲和色谱(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC是用色谱柱技术，把抗体固定在适当的支持物上，制备出用于样品分离纯化的IAC柱，其再与色谱联用，达到很好的分离检测效果。利用抗体与抗原/半抗原可逆的生物专一性相互作用来达到净化和富集分析物的目的。具有高度的选择性和特异性，特别适用于复杂样品基质中痕量组分的分离和富集。将IAC作为理化测定技术的样品净化手段，使样品前处理大大简化，通常一次层析即可使待测物得到高度净化和富集；同时，使用多种抗体制备的IAC柱(MIAC)使免疫分析具备了处理多残留组分的能力。Dietrich等通过免疫小鼠获得抗氨苄西林单克隆抗体。纯化后的Mab1D1与CNBr活化的Sepharose 4B偶联，制备出IAC柱。该IAC柱对氨苄西林和氯唑西林的吸附量分别为6.6μg/mL和5.4μg/mL。缓冲液中阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、双氯西林、青霉素G和苯唑西林在IAC柱的回收率分别为67%～100%。陈号以青霉素类药物母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)偶联牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分别合成两种免疫原和包被原，制备出高效价的抗6-APA的抗血清，经活性检测后被纯化，纯化的IgG偶联CNBr活化的Sepharose4B制备IAC柱，采用HPCE方法对IAC柱柱效进行初步评价。建立的青霉素G标准曲线在1～100μg/mL范围内线性良好，青霉素G样品添加回收率为76.38%～94.67%，CV为5.67%～15.91%。

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