甾类同化激素类药物残留分析技术测定方法（五）

时间：2023-03-25 04:46:44来源：food栏目：食品快速检测阅读：

甾类同化激素类药物残留分析技术测定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(6)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析法实际上是一种以抗体或抗原为分析试剂的特殊分析方法。免疫分析法包括酶联免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)和胶体金免疫层析分析法(GICA)，这三种方法具有特异性强、灵敏度高(可达10-12 g)、操作简单等优点，逐渐成为ASs残留初筛的常用方法。然而，也存在其产生的分析信号反差较高、灵敏试剂弱以及假阳性结果出现率偏高等缺点。

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA是利用被测定的抗原物质和其标记物(标记抗原)同特异性抗体之间存在着竞争性的结合的放射性同位素体外微量分析方法，由于对人体具有放射性危害而较少应用。徐美奕等应用RIA法检测了养殖与野生军曹鱼肌肉中生长激素及雌二醇、孕酮、睾酮等3种ASs的残留量。通过预实验确定鱼肉激素提取液加入量为药盒建议量的2倍。在放免试管中分别加入GH、E2、P、T标准抗原或待测的鱼肉激素提取液、125I标记抗原、抗体，在37℃下的温育时间分别为2.5h、1.5h、0.5h和1h，待免疫反应达到平衡后，4℃下离心(3600r/min)20min，弃去.上清液，用计数器分别测量各反应管沉淀物的放射性计数(cpm)，用SPSS统计软件绘制剂量反应曲线，计算待测鱼肉中的ASs残留量。养殖军曹鱼中3种ASs残留量分别为50.92×10-12、2.08×10-9、0.44×10-9，野生军曹鱼中3种ASs残留量分别为29.78×10-12、1.28×10-9、0.08×10-9。

2)酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA利用抗原抗体之间专--性嵌合特性，对检体进行检测。由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其嵌合机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与嵌合机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以夹心法(sandwich)、间接法(indirect)以及竞争法(competitive)三种为主，具有灵敏度高、特异性好，操作简便等特点，但是存在很难实现多残留分析，存在交叉污染，容易出现假阳性等缺点。夹心法主要用来测大分子物质，而兽药作为-一种小分子物质，夹心法很少使用。本章主要介绍间接竞争ELISA法和直接竞争ELISA法。

A.间接竞争ELISA法

Peng等建立了-种检测猪肉中醋酸甲羟孕酮的间接竞争ELISA检测方法。采用碳化二亚胺和混合酸酐法将药物与牛血清白蛋白(BSA)，免疫获得抗体。该方法LOD为0.096ng/g，可食组织的回收率范围为72%～91%，工作浓度范围为0.1～8.1ng/g。郭金花也开发了醋酸甲羟孕酮的ELISA试剂盒。将肟化后的醋酸甲羟孕酮分别与BSA和卵血清蛋白(OVA)通过混合酸酐法交联，制备免疫抗原MPA-BSA和包被抗原MPA-OVA。以该免疫原免疫兔子后获得的抗血清为基础设计了间接竞争ELISA法。IC50为4.95ng/mL，线性范围为0～100ng/mL，LOD范围为0.1～0.3ng/mL，批内CV小于15%，批间CV小于20%。Jiang等采用间接竞争ELISA检测牛尿中19-去甲睾酮残留。该方法将药物与半抗原偶联免疫BALB/c小鼠获得杂交瘤细胞，获得mAbs亲和力为2.6×109～4.7×109，滴度为0.64×105～2.56×105，IC50为0.55～1.0ng/mL。样品用10%甲醇作为稀释液，进行20倍稀释。建立的间接竞争ELISA检测方法的检测范围是0.004～85.8ng/mL，LOD是0.002ng/mL，IC50为0.55ng/mL。刘剑波等应用间接竞争ELISA法测定了醋酸甲羟孕酮在动物源可食组织中的残留量，并采用GC-MS方法加以确证。比较GC-MS确证方法与ELISA方法所得结果，两者的检测结果相关性良好。

B.直接竞争ELISA法

Jiang等还建立了一种检测牛可食性组织中19-去甲睾酮的直接竞争酶联免疫吸附试验方法(dcELISA)方法。通过细胞融合过程产生高特异性的单克隆抗体(mAbs)，并且建立了基于mAbs的异源性直接竞争ELISA法。方法工作浓度范围是0.004～19ng/mL，IC50和LOD分别为0.28ng/mL、0.002ng/mL(0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，pH7.4)。与β-勃地酮交叉反应率为6.9%，与群勃龙交叉反应率为1.2%。实测样检测时直接竞争ELISA方法与GC-MS相关系数分别为0.9918(牛肉)、0.9834(牛肝)、0.9976(牛肾)。Sawaya等应用直接ELISA方法检测了羊尿液和鸡肉中的雌激素含量。用GC-MS方法检测雌激残留，结果为阴性，为了确证其残留限度，再用ELISA方法进行检测。ELISA试剂盒购自德国R-BiopharmgmbH公司。炔雌醇在尿液中含量范围为0～0.9ppb，在鸡肉组织中含量范围为0～0.3ppb。研究发现，0.3ppb作为ELISA临界点来判定样品的阴性或阳性较为合理。所有样品经GC-MS确证分析都为阴性，此结果表明基质对于ELISA检测存在一定的影响。

3)胶体金免疫层析分析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子(抗体)等的正电荷基团形成牢固的结合。根据胶体金结合物的免疫学特性，因而广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。GICA具有成本低，不需要特殊的仪器设备，使用方便快速，便于基层使用和现场使用的优点，现已开始在残留筛查中使用。

刘丽强研制了用于检测19-去甲睾酮残留的竞争性胶体金免疫层析试纸条。检测线和质控线分别用金标点样仪喷涂0.5mg/mL的19-去甲睾酮-OVA包被抗原和0.2mg/mL的羊抗兔IgG二抗。检测添加19-去甲舉酮的猪尿样本时，LOD为200ng/mL，通过使用Imag J 软件对试纸条进行定量分析，可以得到的LOD为25ng/mL。Jiang等建立了检测牛肉和猪肉中19-去甲睾酮的胶体金免疫分析方法。采用改良碳二亚胺法合成人工抗原(见图8-7)，免疫BALB/c小鼠获得mAbs。胶体金试纸条在PBS中LOD为1ng/mL，牛肉和猪肉中LOD均为2ug/kg，结果可在10min内读出。田壮建立了胶体金快速检测技术，确保能对19-去甲基睾酮进行准确、快速、高灵敏度的检测。选择用20nm左右的胶体金纳米粒子标记19-去甲睾酮抗体，标记pH为8.6，标记浓度为7.2ug(抗体)/mL(金)，最终LOD可达到5ng/mL。

图8-7 采用EDC法合成19-去甲睾酮人工抗原方法

Wei等建立了炔诺酮的胶体金检测方法。应用了带有氨基功能基团的中空硅胶颗粒，可用于固定金颗粒，再连接辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗用来检测炔诺酮抗原，LOD可以达到3.58pg/mL，重复性、稳定性、灵敏度均较好。

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