甾类同化激素类药物残留分析技术——前处理方法（四）

时间：2023-03-25 04:18:43来源：food栏目：食品快速检测阅读：

甾类同化激素类药物残留分析技术——前处理方法（四）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(4)衍生化方法

由于ASs的沸点高不易挥发，通过化学衍生可以增加样品的挥发度或提高检测灵敏度，从而利于气相色谱(GC)检测，在ASs的残留检测中通常采用硅烷化和酰化等衍生法。而HPLC的化学衍生法则是在一定条件下利用化学衍生试剂或标记试剂与样品组分进行化学反应，产物有利于检测或分析。衍生化方法主要有：硅烷化法、酰化法、酯化法、卤化法、环化法。

1)硅烷化衍生

硅烷化是ASs最普遍的衍生化方式，常用的硅烷化试剂有：三甲基硅烷(TMS)、双(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(BSTFA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)和N，O-双(三甲硅基)乙酰胺(BSA)等。ASs结构中凡含活泼氢原子基团均可发生硅烷化反应，如羟基、酚羟基、可烯醇化的酮基、氨基、羧基、硫酸等，生成TMS醚、TMS烯醇醚、TMS胺或TMS酯衍生物。一般还需加入催化剂以提高对位阻基团的硅烷化能力。常用的催化剂包括叠氮基三甲基硅烷、N-三甲基咪唑(TMSim)、三甲基氯硅烷(TMCS)、三甲基碘硅烷(TMIS)和乙酸钾。除乙酸钾外，大部分催化剂自身也是硅烷化试剂。TMCS和TMIS可产生卤酸，反应液中需加入酸受体物质，如吡啶等。目前，ASs残留检测主要采用MSTFA进行硅烷化衍生。

Marchand等采用GC-MS检测肉中的超痕量ASs。SPE洗脱液旋转蒸干后，通过液液分配将ASs分为两类：含D4-3-酮类和酚结构类。D4-3-酮类具体衍生条件：加入MSTFA-TMIS-DTT(1000+5+5，v/v/w)60℃孵育40min；酚结构类具体衍生条件：MSTFA-I2(1000+4，v/v)，室温反应，再用GC-MS测定。该方法测得23种ASs的LOD为5～100ng/kg。

Impens等建立了检测肾脂肪和肉中雌激素、孕激素和雄激素残留的GC-MS/MS方法。SPE洗脱液氮气吹干后，采用MSTFA进行衍生。将样品转移至自动进样小瓶内，氮气吹干，加入25μL mSTFA涡动混匀，进行衍生后，用气相色谱-离子阱-多级质谱法(GC-IT-MSn)检测。该方法测得雌激素、孕激素和雄激素的CCa为0.5～5ug/kg，CCβ为0.5～2.5ug/kg。

Yamada等报道了采用GC-MS/MS同时检测马尿中多种蛋白同化类固醇主要代谢物的方法。尿液经β-葡萄糖醛酸酶水解后，用Sep-Pak C18 PlusSPE柱净化，洗脱液氮气吹干后，加入叠氮基三甲基硅烷，80℃衍生化反应30min后，用GC-MS/MS在MRM模式下检测。方法LOD为5～50ng/mL，平均回收率为71.3%～104.8%，CV为1.1%～9.5%。

Kootstra等建立了尿液中ASs多残留检测的GC-MS方法。该方法采用TMS进行衍生，主要用于定性和半定量分析低剂量的ASs。衍生化条件为：加入30μL TMS，60℃孵育1h，衍生化产物氮气吹干(60℃)，加入异辛烷超声溶解后，GC-MS检测。该方法在添加浓度为1μg/L时，测得ASs的CCa为0.06～0.77μg/L，CCβ为0.09～0.46μg/L；添加浓度为2μg/L时，测得ASs的CCa为0.26～0.54μg/L，CCβ为0.44～0.92μg/L，准确度为92.6%～122.2%。

2)酰化衍生

酰化也是较为常用的衍生化方法，主要针对ASs的羟基、可烯醇化的酮基和氨基。衍生化试剂可分为三类：酰氯、全氟代酸酐和含有活性酰基的化合物(如酰基咪唑)。常用的酰化试剂有七氟丁酸酐(HFBA)、五氟苯甲酰氯、N-甲基-双-三氟代乙酰胺和三甲基乙酸酐等。酰化衍生物易于制备，一般将待测物溶于吡啶或四氢呋喃，加入过量的酰化剂即可。

曾东平等建立了猪肌肉中甲基睾酮、炔诺酮、17a-乙炔雌二醇、雌二醇、6a-甲基-17a-羟基孕酮、苯甲酸雌二醇和醋酸氯地孕酮等8种性激素残留的GC-MS检测方法。猪肌肉样品经过乙醚提取，氨基SPE柱净化，浓缩后，加入50μL hFBA-丙酮(1+4，v/v)，于60℃静置衍生反应1h，再加入700μL甲苯和500μL双蒸水，混匀离心后取上层供GC-MS检测。在2.5～50μg/kg浓度范围保持良好线性，相关系数大于0.97；在2.5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg添加水平下，8种性激素的回收率为67.7%～148%；方法LOD为0.94～2.41μg/kg，LOQ为3.13～8.03μg/kg。李青等采用乙醚和石油醚提取畜禽肉及内脏中的雌二醇，在净化、吹干的试样残渣中加入1mL衍生剂HFBA，超声20min，氮气吹干，再加入0.5mL异辛烷，混匀后GC-电子捕获检测器(ECD)检测。方法LOD为0.5μg/kg，回收率为84.0%～93.0%。

我国国家标准GB/T22967-2008、GB/T20749-2006分别检测牛奶、奶粉中β-雌二醇残留量和牛尿中β-雌二醇残留量。样品经过β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶水解和HLBSPE柱净化后，洗脱液氮气吹干后，用五氟苯甲酰氯于60℃衍生化15min，再用GC-MS测定，内标法定量。牛奶和牛尿的LOD均为0.25μg/kg，奶粉的LOD为2μg/kg，牛奶中回收率为84.1%～95.3%。

3)羟胺衍生化

羟胺衍生化又称为肟化。肟是含有羰基的醛、酮类化合物与羟胺类物质作用生成的一类化合物。羟胺衍生化是根据甾体类激素的酮基可提供进行亲核加成部位的性质，以羟胺类物质为衍生化试剂，将甾体类激素的酮基在一定条件下与羟胺类物质进行亲核加成反应，生成肟类物质。常见的试剂如盐酸羟胺、0-甲基羟胺、0-苯基羟胺、0-丁基羟胺、0-五氟苄基羟胺，生成肟或烷基肟，也常作为保护ASs酮基的方法。

Regal等建立了牛血清中雌激素的LC-MS/MS检测方法。血清样品经乙腈提取和正己烷除脂，氮气吹干，然后用1.5mol/L羟胺溶液(pH10)进行羟胺衍生化，90℃反应30min，衍生化产物用叔丁基甲醚提取，浓缩后复溶于甲醇-水中，最后用LC-MS/MS分析。方法CCa为6.00～19.46ng/L，CCβ为11.84～33.02ng/L。

4) 其他衍生方法

Athanasiadou等对增强ESI电离的化学衍生化方法进行了综述，具有很好的参考意义。以19-去甲雄酮为例，分别列举了其羰基(图8-4)、羟基(图8-5)可发生的化学衍生化方法及衍生化产物。

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