非甾类同化激素类药残留分析前处理方法——净化（一）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(3)净化方法

经典的净化处理方法主要有液液分配(LLP)，随着科学技术的发展和兽药残留检测要求的不断提高，各种新技术、新手段也被用来作为生物样品中非甾类同化激素的样品前处理方法，包括固相萃取(SPE)、分子印迹(MIT)、免疫亲和色谱(IAC)、固相微萃取(SPME)、基质固相分散法(MSPD)等。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP是利用样本中的待测物与干扰物在互不相溶的两种溶剂(溶剂对)中分配系数的差异进行分离的净化方法，通常使用一种能与水相溶的极性溶剂和一种不与水相溶的非极性溶剂配对来进行分配，经过反复多次分配，使待测物与杂质分离。LLP是最常用的净化手段，常与其他方法结合用于提取液的脱脂等。

Shin等采用LLP方法提取和净化老鼠血清中的ZON。在老鼠血清中加入叔丁基甲基醚，涡动混合，离心，有机层氮气吹干，加入乙腈-0.1%三乙胺溶液(50+50，v/v)复溶，涡动混合，离心后，取上清液HPLC分析。该方法回收率为79.3%～96.2%，日内和日间CV低于12.1%，LOQ为10ng/mL。曹莹等利用LLP净化鸡肝脏中ZER残留。鸡肝酶解液中加入乙醚，旋涡振荡，离心，吸取上层液，旋转蒸发至干后，加入二氯甲烷和1mol/L氢氧化钠溶解，上清液用乙酸调节pH5，用乙醚LLP净化，收集上层溶液，旋转蒸发至干，残余物用0.3%乙酸-乙腈(55+45，v/v)溶解，供LC-MS分析。该方法的LOQ为4ng/g，回收率为65.0%～86.4%，CV为5.1%～15.4%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE利用吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品基体、干扰物质分离，然后通过洗脱液洗脱或加热解吸附，分离和富集目标物。与传统LLP相比，SPE不需要大量有机溶剂，不产生乳化现象，可净化很小体积的样品，是目前兽药残留分析中样品前处理的主流技术。但SPE易将共存干扰物萃取出来，且富集倍数有限。

A.二苯乙烯类

在二苯乙烯类化合物的分析方法中，硅胶柱、HLB柱、石墨化碳黑(GCB)柱、氨基柱(NH2)和硅藻土柱等都被用于动物基质中二苯乙烯类的净化。

许泓等采用硅胶SPE柱净化动物源食品中的DES、HES和DIS残留。用6mL正已烷分两次预洗硅胶柱，流速4mL/min；上样，流速2mL/min，在样品试管中加入3mL淋洗液(乙酸乙酯-正己烷，6+94，v/v)，混合后过柱，流速2mL/min；用3mL淋洗液以3mL/min流速淋洗，2mL空气流以4mL/min流速吹过硅胶柱；用6mL洗脱液(乙酸乙酯-正己烷，25+75，v/v)洗脱，流速2mL/min，2mL空气流以6mL/min流速吹过硅胶柱，收集洗脱液，氮气吹干，加1mL流动相(乙腈-水，70+30，v/v)溶解后，供LC-MS/MS测定。该方法对DES、DIS的LOD为0.05ng/g，在0.5～10ng/g范围内，回收率为84%～108%；对HES的LOD为0.025ng/g，在0.25～5ng/g范围内，回收率为59%～87%。

吴银良等也利用硅胶SPE柱净化动物组织中DES、DIS和HES。在碱性条件下用乙酸乙酯提取，提取液过硅胶SPE柱(5mL正己烷、5mL乙酸乙酯活化)，依次用2mL正已烷、2mL正己烷-乙酸乙酯(85+15，v/v)混合溶剂淋洗，并抽干，用4mL正已烷-乙酸乙酯(80+20，v/v)混合溶剂洗脱，收集洗脱液，GC-MS分析。方法的LOD为0.30μg/kg(DES)、0.10μg/kg(HES)和0.15μg/kg(DIS)；在0.5～4.0ug/kg添加水平，回收率为73.0%～86.5%，RSD为1.0%～7.2%。Lohne等用乙腈提取鱼肉中的DES、DIS和HES，然后用硅胶SPE柱净化，LC-MS/MS测定。DIS、DES和HES的平均回收率分别为119%、99%和104%，RSD分别为18%、11%和15%；LOD低于0.21ng/g，LOQ在0.18～0.65ng/g之间。

徐英江等用HLB柱净化草鱼血液、肌肉和肝脏中的DES。采用10%碳酸钠和乙酸乙酯提取，提取液用1mL甲醇溶解残留物，再加9mL水稀释，过SPE柱。HLB小柱依次用10mL乙酸乙酯、10mL甲醇和10mL pH3的盐酸溶液活化，上样后，用10mL水-甲醇(9+1，v/v)淋洗，抽干，再用10mL正已烷淋洗，抽干，用5mL乙酸乙酯洗脱。控制整个过程流速不超过2mL/min。收集洗脱液，氮吹至近干，流动相复溶、过膜，进LC-MS/MS测定。该方法LOD可达0.5μg/kg，LOQ可达1.0μg/kg；DES的平均回收率在85.0%～108%之间，批内RSD在7.12%～8.65%之间；DIS的平均回收率在73.1%～80.2%之间，批内RSD在5.02%～7.49%之间。

丁雅韵等采用基质固相分散(MSPD)提取和净化动物肝脏中的DES，洗脱液再过碱性硅藻土和硅胶SPE柱净化。1.5mLKOH溶液(0.25mol/L)加入0.50g硅藻土中，剧烈振荡，静置15min，转移到底部有筛板的固相萃取空柱中，在固相萃取装置上用20mL甲苯-异辛烷(1+9，v/v)淋洗，抽干。MSPD洗脱液残渣用100μuL甲苯和0.4mL异辛烷溶解并定量转移到硅藻土柱上，用10mL甲苯-异辛烷(1+9，v/v)淋洗，抽干，用10mL水饱和的乙醚洗脱，收集洗脱液，N2吹干，再用100μL二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)溶解并定量转移到硅胶柱上。硅胶柱已用5mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)和5mL正已烷活化。上样后用5mL正己烷淋洗，5mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)洗脱，洗脱液N2吹干，衍生化后，进GC-MS测定。该方法LOD低于1μg/kg，回收率为81.6%～100.9%，RSD为8.7%～13.2%。

Yang等报道了猪肉、牛肉、虾、牛奶和肝脏中的50种同化激素类(包括DIS、HES和DES)的残留分析方法。采用GCB串联NH2SPE柱对样品进行了净化。样品经酶解和甲醇提取后，提取液用超纯水稀释，以3～5mL/min的速度过SPE柱净化。GCB柱分别用6mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)、6mL甲醇和6mL水平衡。提取液全部通过GCB柱后，用1mL甲醇洗涤，真空抽干GCB柱，NH2柱用4mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)平衡后接在GCB柱下部，8mL二氯甲烷～甲醇(70+30，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干，1mL甲醇-水(1+1，v/v)复溶后，LC-MS/MS检测。该方法的LOQ为0.04～2.0μg/kg，平均回收率为76.9%～121.3%，CV为2.4%～21.2%。该研究同时比较了C18柱串联NH2柱和HLB柱串联NH2柱的净化效果。结果发现，GCB-NH2、C18-NH2和HLB-NH2都可以取得满意的回收率，但C18-NH2和HLB-NH2净化会产生较强的基质抑制效应，DIS、HES和DES的基质抑制率为58%～88%，GCB-NH2净化的基质抑制率为28%～36%。

B.RALs

强阴离子交换柱(MAX)、NH2柱等常被用于动物基质中RALs的净化。

Xia等采用MAX柱净化牛奶中的ZER、TAL、ZAN.ZON、a-ZOL和β-ZOL。在5mL牛奶中加入5mL乙腈，涡动30s，9000r/min离心5min(4℃)，取上清液，加入1.0mL氨水(2.5mol/L)和10mL水，混匀后过MAX柱(2mL乙腈和2mL水平衡)，2mL5%氨水和0.5mL乙腈洗涤，真空干燥2min，3mL乙酸-乙腈溶液(2+98，v/v)洗脱，50C水浴中氮气吹干，0.5mL水-乙腈(50+50，v/v)复溶，过0.22um微孔滤膜后，LC-MS/MS分析。该方法平均回收率为92.6%～112.5%，CV低于11.4%，LOD和LOQ分别为0.01～0.05μg/L和0.05～0.2μg/L。钱卓真等利用NH2柱净化水产品中的ZER、TAL、ZAN、ZON、a-ZOL和B-ZOL。样品经乙腈提取，正已烷脱脂，下层乙腈溶液旋转蒸发至干，乙腈饱和正己烷溶解备用。将NH2柱用5mL乙酸乙酯、5mL正己烷平衡。取提取液过柱，流速不超过1mL/min，再依次用5mL正已烷、5mL正已烷-乙酸乙酯(60+40，v/v)淋洗，4mL正己烷-乙酸乙酯(20+80，v/v)和4mL乙酸乙酯洗脱。洗脱液于50C下氮气吹干，1mL乙腈-水溶液(20+80，v/v)定容，过0.22μum微孔滤膜后，LC-MS/MS分析。该方法LOQ为1.0lg/kg，回收率为75.9%～103.8%，RSD为3.90%～13.5%。

C.二苯乙烯类和RALs同时净化

动物源基质中的二苯乙烯类化合物和RALs也可以采用SPE进行同时净化。

Rubies等建立了SPE-LC-MS方法检测动物尿液中的TAL、ZER、HES、DES和DIS等药物。尿液酶解后用HLB固相萃取柱净化，LC-MS/MS检测。该方法的回收率为71.4%～106.4%；CCa为0.2～0.9ug/L，CCβ为0.3～1.0ug/L。Kathrin等2建立了采用SPE同时净化牛尿中二苯乙烯类化合物(DES、DIS、HES)和RALs(ZER、TAL、a-ZOL、β-ZOL和ZON)的方法。5mL尿液样品中加入2mL乙酸钠缓冲液(2mol/L，pH5.2)，加入100μL蜗牛液(Helixpomatiajuice)，37℃避光放置16h或50℃放置3h，水解完成后用2mol/L氢氧化钠溶液调pH9.0+0.1，5mL乙醚提取2次，旋转蒸干，加入1.5mL甲醇和3mL水，2mL正已烷洗涤2次，弃掉正已烷层，过已用5mL甲醇和5mL水平衡的HLB柱(6cm3，200mg)，5mL甲醇和5mL甲醇-水(55+45，v/v)洗涤，5mL丙酮洗脱，洗脱液再过经5mL甲醇和5mL丙酮平衡的aminopropyl柱(500mg，3mL)，流出液蒸干后，用100μL乙腈-水(1+1，v/v)复溶，LC-MS/MS分析。该方法检测二苯乙烯类化合物和RALs的LOD分别低于1μg/L和1.5μg/L，回收率分别为99.2%～106.0%和99.4%～107.9%。

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