液相色谱-串联质谱法测定牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.2.1 适用范围

适用于牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的液相色谱-串联质谱法测定。方法检出限：玉米赤霉醇和己烷雌酚为0.5μg/L；己烯雌酚和双烯雌酚为1.0μg/L。

9.2.2.2 方法原理

免疫亲和柱内含有的特异性抗体选择性地与牛尿试样中己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和玉米赤霉醇结合，形成抗体-抗原复合体，用水淋洗柱除去杂质，用洗脱剂洗脱吸附在柱上的目标物，收集洗脱液。试液用液相色谱-串联质谱仪测定，保留时间和离子丰度比定性，内标法定量。

9.2.2.3 试剂和材料

甲醇、乙醇、乙腈：色谱纯。

淋洗液：将Randox试剂盒中提供的淋洗原液用去离子水按1：20稀释。

洗脱液：乙醇+水(70+30，v/v)。量取70mL乙醇与30mL去离子水混合。

储备液：将Randox试剂盒中提供的储备原液用去离子水按1：5稀释。

激素标准物质：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)纯度≥97%；己烯雌酚，纯度≥99%；己烷雌酚，纯度≥98%；双烯雌酚，纯度≥98%。

激素标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚和双烯雌酚标准物质，用甲醇配制成1.0mg/mL标准储备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3个月。

内标标准物质：玉米赤霉醇-4氘代(包括Q-玉米赤霉醇-4氘代和β-玉米赤霉醇-4氘代，各50%)，纯度≥99%；己烯雌酚-8氘代，纯度≥98%。

内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代标准物质，用甲醇分别配制成1.0mg/mL标准储备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3个月。

免疫亲和层析柱：Randox(英国)或相当者；玉米赤霉醇免疫亲和层析柱：亲和柱的最大容量为100ng玉米赤霉醇；二苯乙烯免疫亲和层析柱：亲和柱的最大容量为50ng己烯雌酚，50ng己烷雌酚，50ng双烯雌酚。

9.2.2.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱联用仪：配有大气压化学电离源；离心机：转速大于3000r/min；氮气浓缩仪；涡旋振荡器。

9.2.2.5 样品前处理

(1) 试样制备

取有代表性样品，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。将试样置于2~8℃下保存。

(2) 样品称取

取5个阴性牛尿样品，每个10mL，于50mL离心管中，3000r/min离心15min。向5支10mL试管中，分别加入不同量混合标准工作溶液，使玉米赤霉醇和己烷雌酚的浓度为1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量混合内标标准工作溶液，使其浓度均为10ng/mL。加入3mL离心后牛尿的上清液，涡旋30s溶解，待净化。

(3) 净化

用15mL淋洗液分两次预洗免疫亲和层析柱，流速不大于3mL/min。上样，自然流速。用5mL淋洗液以不大于2mL/min的速度淋洗，等体积重复淋洗一次，再用5mL去离子水以不大于2mL/min的速度淋洗。用4mL洗脱液洗脱，流速不大于2mL/min，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解。溶液经滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

(4) 试样溶液的制备

取经3000r/min离心15min后待测样品3mL于50mL离心管中，加入内标标准工作溶液，使其含量均为2.0μg/kg。按上述步骤操作。

(5) 空白基质溶液的制备.

取经3000r/min离心15min后阴性样品3mL于50mL离心管中，按上述步骤操作。

9.2.2.6 测定

(1) 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAXEclipseSB-C8，3.5μm，150mm×4.6mm，或相当者；柱温；25℃；流动相：乙腈-水(70+30，v/v)；流速：1.0mL/min；进样量：50μL。

(2)质谱条件

离子化方式：大气压化学电离；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：325℃；雾化气压力：15psi；气帘气压力：10psi；辅助气1压力：35psi；喷雾器电流：-5μA；电喷雾电压：-4500V；定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压见表9-4。

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