硝基呋喃类代谢物最大允许残留限量和分析技术——前处理方法（二）

时间：2023-03-25 05:08:49来源：food栏目：食品快速检测阅读：

硝基呋喃类代谢物最大允许残留限量和分析技术——前处理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)提取和净化

NFs代谢物检测过程中常用的样品提取、净化方法包括液液分配法(LLP)、固相萃取法(SPE)和沉淀法等，近年来超临界流体萃取(SFE)、基质固相分散技术(MSPD)等也有应用。

1)沉淀法(precipitation)

对于奶粉、蛋粉等高蛋白、高脂肪样品，在水解、衍生化蛋白结合态硝基呋喃代谢物后，可加入蛋白质沉淀剂ZnSO4和K4Fe(CN)6，有效去除奶粉、蛋粉中的蛋白，避免提取、净化过程中的乳化、胶化现象。彭涛等22用LC-MS/MS法同时测定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物。盐酸水解奶粉中蛋白结合的代谢物，同时加入2-硝基苯甲醛，37℃过夜衍生化。加入ZnSO4，调至pH7.0后，再加入K4Fe(CN)6去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取，正己烷净化，分析物采用电喷雾电离(ESI)正离子、多反应监测(MRM)模式检测，内标法定量。在添加浓度0.5～2μg/kg范围内，内标法回收率为89.5%～110.3%；相对标准偏差(RSD)小于11.3%；AMOZ、AOZ方法LOD为0.05ug/kg，SEM、AHD为0.1μg/kg。

对于蜂王浆样品，三氯乙酸是一种很好的蛋白沉淀剂，同时其较强的酸性又可以提供合适的酸性反应环境。丁涛等报道了LC-MSMS测定蜂王浆中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4种NFs代谢物残留的方法。以三氯乙酸作为蜂王浆的蛋白质沉淀剂，同时提供衍生化反应所需的酸性环境。实验发现pH7～7.5时，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代谢物的衍生产物提取效率最高，分别为92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。在不同的pH条件下，4种代谢物的衍生产物的萃取效率影响不一样。对于AHD而言，当pH8～10时，萃取效率极低；对于AMOZ而言，当pH3～5时，完全不能将其从水相中提取至有机相中。AOZ和SEM对pH的敏感程度不是很高，但是在弱碱性条件下(pH7～7.5)，提取效率最高。因此，在进行提取步骤的时候，需要进行比较准确的pH调节，才可以最大限度地提取4种代谢物的衍生产物。

2) 液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

NFs代谢物的LLP，一般是在pH7的水溶液中与乙酸乙酯进行两相分配。但这种方法有时出现乙酸乙酯和水相分层不彻底的情况，易产生干扰，从而影响回收率。特别是对高蛋白、高脂肪、高淀粉的样品，可加入少量的十二烷基磺酸钠以缓解乳化现象。为达到更好的净化效果，也常采用正己烷对提取液做进一步净化。

Lopez等应用10%氯化钠溶液来溶解蜂蜜，离心之后取上清液过OasisHLB固相萃取柱，用洗脱液进行水解和衍生化反应。调节pH7.15～7.25之后，用正己烷LLP除脂，然后再用乙酸乙酯LLP。有机相浓缩后用甲醇和水复溶，过0.2um的PTFE滤膜完成样品的前处理。Rodziewicz建立了牛奶中NFs代谢物的LC-MS方法。牛奶样品经离心(3500r/min，10min，4℃)去除上层脂质层后进行水解衍生化，冷却至室温后，加入磷酸钠和NaOH调节pH，再用乙酸乙酯进行LLP，收集有机相蒸干并复溶于流动相中，过滤膜后上LC-MS/MS检测。

同时，样品溶液的pH对萃取效率有很大的影响。丁涛等试验了不同pH对回收率的影响，发现pH在7.0～7.5时，AHD、AOZ、SEM、AMOZ衍生化产物的提取效率最高，分别为92.1%、95.1%、91.4%、94.3%。

3) 固相萃取法(solidphaseextraction，SPE)

SPE广泛应用于动物组织样品中NFs代谢物的净化。主要有基于反相保留原理的C18、HLB、EN、CN柱，基于离子交换原理的MAX柱等，多种原理的串联柱、复合用柱也被大量采用，显著提高了净化效果。

彭涛等对普通C18SPE柱和以乙烯吡咯烷酮-_二乙烯基苯共聚物为吸附剂的OasisHLBSPE柱进行比较，发现后者对分析物有很强的选择性保留，而大多数基质干扰物则保留较弱。共聚物吸附剂可能通过π-π作用而使硝基芳烃衍生物保留。Hormazabal等应用85%三氯乙酸来提取猪肉中的NFs代谢物，正己烷LLP除脂，然后进行衍生化反应，选择OasisHLB柱进行净化，乙腈-水(70+30，v/v)作为洗脱液进行洗脱，而后加入--定体积的三氯甲烷从洗脱液中萃取出目标化合物，经离心去除水相，转移有机相后蒸干，复溶于水中，过滤膜后用LC-MS检测。庞国芳等应用LiChrolutEN柱对禽肉中经过水解和衍生化的NFs代谢物进行净化，采取pH7.4的缓冲液淋洗SPE柱，再用乙酸乙酯进行洗脱，氮气吹干后用流动相进行复溶，最后用仪器测定。该方法重点研究了不同处理步骤对结果的影响。研究发现，当衍生化后反应溶液调pH并用乙酸乙酯提取两次，这种方法有时会出现乳化现象，乙酸乙酯和水相分层不彻底，易产生干扰，从而影响回收率。另一方面则是比较4种不同的SPE柱的净化效果和回收率：OasisMAX(60mg，3mL，Waters)、OasisHLB(60mg，3mL，Waters)、C18(500mg，3mL，J.T.Baker)、LiChrolutEN(200mg，3mL，Merck)。结果发现，LiChrolutEN柱的净化效果和回收率优于另外三种SPE柱。林黎明等比较了MAX、HLB复合柱法、ENSPE单柱法、HLB单柱法和乙酸乙酯LLP方法，比较了甲醇-乙酸洗脱液和乙酸乙酯洗脱液的效果，最终确定主要采用的提取和净化步骤是：对于肉类组织采用ENSPE柱净化，乙酸乙酯洗脱；对于肝、虾等易产生高度混浊滤液的样品则先采用乙酸乙酯提取，再用ENSPE柱净化。实验表明，MAX、HLB复合柱法操作较繁，并要求严格控制洗脱液的pH；而单纯采用LLP法，对某些复杂样品净化效果不佳。实验研究了在样品处理过程中添加适量硅藻土，与样品同时研磨，改变其黏稠性，再进行水解，可明显提高净化效果，回收率可达70%～95%，实验表明HLB柱与EN柱有同样的效果。

王媛等提取水产品中的NFs代谢物，为了去除提取物中的水溶性杂质，采取LLP的方法，将被测物萃取到有机相中，进行初步净化。将衍生化之后的上清液调至pH7.0左右，然后用30mL乙酸乙酯分两次萃取，可以达到良好的效果。进一步的净化采用C18-CN混合柱，洗脱SPE柱时，比较了2mL甲醇和5mL乙酸乙酯对4种组分的洗脱效果。用5mL乙酸乙酯洗脱时，AMOZ的回收率偏低，仅为50%，其他3个组分可以满足残留检测要求，回收率在90%～110%；采用2mL甲醇洗脱，各组分的回收率都高于80%，但甲醇用量过大也会使杂质与目标化合物一起被洗脱出来。Conneely等建立了动物肝脏组织中NFs代谢物的LC-MS/MS方法。绞碎匀浆的肝脏组织经甲醇和水洗涤，然后再依次经预冷的甲醇、乙醇和乙醚洗涤，离心后保留下层固相样品，加入盐酸溶液和酶进行水解和衍生化反应，经乙酸乙酯提取三次后用氮气吹干，复溶于Tris缓冲液中(pH6.3)，然后用两种串联的SPE柱纯化。先用OasisMAX柱净化，以甲醇、水和Tris缓冲液(pH6.3)进行活化，随后用2%氨水淋洗，甲醇进行洗脱。洗脱液用氮吹浓缩后复溶于水中。第二级净化柱为OasisHLB，用甲醇和水进行活化，50%的甲醇溶液(含2%的乙酸)进行洗涤，之后应用90%的甲醇溶液(含2%的氨水)洗脱衍生化代谢物。洗脱液氮气吹干后复溶于水-乙腈(2+1，v/v)溶液中，过滤膜后LC-MS/MS分析。肝脏样品的分析相对更为困难，容易产生干扰和严重的离子抑制现象，串接的SPE方法纯化样品并保证了回收率，是处理复杂基质样品的有效手段。

4)超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE具有高效快速、节约溶剂等优点，但是需要在专门的仪器中才能实现。Arancibia等利用SFE技术来提取、净化尿液中的呋喃妥因及其代谢物。使用SFE-400超临界萃取装置，10mL的不锈钢管作为提取柱，熔融的石英管作为限流装置，乙腈作为修饰剂，乙腈-CO2混合提取液的流动速度为0.5mL/min，压力为2500psi，炉温和限流器的温度为80℃，萃取时间为20min。萃取液采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UVD)在310nm测定。呋喃妥因的线性范围为10.9～378.0umol/L(R=0.9995)，其代谢物为3.0×103～21.0umol/L(R=0.9992)；检测限分别为12.1umol/L和0.9umol/L。

5)加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

安强等建立了利用ASE-HPLC快速测定动物源食品中NFs代谢产物的方法。称取已捣碎的样品10.0g，与20g硅藻土混合均匀，填入33mL的萃取池中，萃取池放入ASE仪的加热炉腔内，在设定的萃取条件下完成萃取过程。作者优化了萃取溶剂、萃取温度、萃取压力、萃取时间等条件。最佳萃取溶剂为体积比1：1的甲醇-三氯乙酸(0.68mol/L)，最佳萃取温度100℃，最佳萃取压力1.0×107Pa，最佳萃取时间10min×3次。萃取液冷却过滤后，用邻氯苯甲醛衍生化，NaOH调至pH7.0，乙酸乙酯LLP，再过C18-CN混合SPE柱净化，用HPLC-UVD检测。方法LOD(S/N=3)为：SEM 0.005μg/mL，AHD 0.005μg/mL，AMOZ 0.005μg/mL，AOZ 0.005μg/mL；添加浓度5.0mg/kg时的回收率分别为：SEM88.6%±3.8%，AHD82.9%±4.9%，AMOZ89.3%±3.9%，AOZ93.7%±3.8%。Tao等利用ASE和超声波加速衍生技术建立了鲤鱼和黄鳝中4种NFs代谢物的测定方法。采用ASE提取分析物，超声波中衍生反应1h，再用SPE进行净化。方法的CCa在0.07～0.13μg/kg之间，CCβ在0.31～0.49μg/kg之间，方法回收率为77.2%～97.4%。与传统方法相比，该方法大大缩短了前处理时间。

6)固相支撑液液萃取(solid-supported-liquid-liquidextraction，SSLLE)

祝伟霞等采用硅藻土SSLLE和平行蒸发联用前处理技术进行净化和富集，建立了鸡肉、蜂蜜、牛奶中呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃妥因代谢物(AHD)和呋喃西林代谢物(SEM)的超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)确证方法。NFs代谢物经衍生化后，采用超高效1.7μm C18柱分离4种待测物，同位素内标法定量。AOZ和AMOZ的最低检测限为0.1μg/kg，AHD和SEM为0.25μg/kg；3个不同添加水平时该方法回收率为85.6%～104.3%，RSD为3.2%～9.5%。样液在柱中的平衡时间是影响回收率的重要参数，该研究分别测定不同平衡时间对萃取效率的影响，结果表明30min时溶液能与硅藻土填料形成牢固的支撑作用。同时优化了不同体积乙酸乙酯的萃取效率，20mL乙酸乙酯回收率为85%，40mL乙酸乙酯在重力作用下能完全萃取固相萃取柱中4种NFs代谢物。

7)基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

曹文卿等采用MSPD技术，经LLP净化，同位素内标定量，建立了蛋黄粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代谢物残留的LC-MS/MS测定方法。利用硅藻土为基质分散剂对蛋黄粉进行基质分散，三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解环境，2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯LLP等前处理手段对蛋黄粉中的NFs代谢产物进行了提取和净化。该方法LOQ为0.5μg/kg，线性范围为0.5～6.0μg/kg，室内验证回收率范围为90.06%～109.8%，RSD为2.0%～7.7%。该方法适用于残留检测实验室对蛋黄粉类基质中NFs代谢产物的监控检测。

上一篇：硝基呋喃类代谢物最大允许残留限量和分析技术——前处理方法（一）

下一篇：液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留样品前处理