液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留样品前处理

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

7.2.1.5 样品前处理

(1)猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝、鱼类、虾蟹类和贝类样品

1)试样制备

实验室样品用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样。试样置于-18℃冰柜，避光保存。

2)样品称取和脱脂

称取样品2g(精确到0.01g)，置于50mL棕色离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液(2+1，v/v)，均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉。向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终测定浓度均为2.0ng/mL。

3)水解和衍生化

向上述离心管中加入10mL 0.2mol/L盐酸溶液均质1min，用10mL 0.2mol/L盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3mL衍生剂，用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。

4)净化

上述衍生溶液放置至室温后，加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，用1mo/L氢氧化钠溶液调节溶液pH约为7.4，4000r/min离心10min，上清液(若待测样品含脂肪较多，上清液加5mL正已烷，振荡2min，4000r/min离心10min吸取并弃掉正己烷)倒入下接OasisHLB固相萃取柱的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液。用真空泵在65kPa负压下抽干OasisHLB固相萃取柱15min。用5mL乙酸乙酯洗脱被测物于25mL棕色离心管中，使用氮气吹干仪，在40℃水浴中吹干，用样品定容液溶解并定容至1.0mL，混匀后过0.2um滤膜用液相色谱-串联质谱测定。

5)混合基质标准校准溶液的制备

称取五个阴性样品，每个样品为2g(精确到0.01g)，置于50mL棕色离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液(2+1，v/v)，均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉。分别加入适量混合标准溶液，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg、4.0μg/kg和8.0μg/kg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液，含量均为2.0ng/mL。其他按照样品的水解衍生化和净化步骤操作。

(2)牛奶或奶粉样品

1)试样制备

实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样。试样置于-18℃冰柜，避光保存。

2)牛奶样品脱蛋白、水解和衍生化

称取牛奶样品8g(精确到0.01g)，置于50mL棕色离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液。向上述离心管中加入0.2mL衍生剂，再加入适量混合内标溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。离心管取出后放置至室温，在10000r/min下离心10min，上清液倒入另-棕色离心管中。

3)奶粉样品脱蛋白、水解和衍生化

称取奶粉样品1g(精确到0.01g)，置于50mL棕色离心管中，加入8mL水，涡旋混合后，再加入15mL三氯乙酸溶液。向上述离心管中加入0.2mL衍生剂，再加入适量混合内标溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。离心管取出后放置至室温，在10000r/min下离心10min，上清液倒入另一棕色离心管中。

4)样品溶液净化

上述衍生溶液加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，用4mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH约为7.4，在10000r/min下离心10min，上清液倒入下接OasisHLB固相萃取柱的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后用20mL 20%甲醇水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。抽干OasisHLB固相萃取柱15min。用5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于25mL棕色离心管中，在氮气吹干仪上45℃水浴吹干，准确加入1.0mL样品定容溶液溶解残渣，混匀后过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

5)牛奶混合基质标准校准溶液的制备

称取五个阴性牛奶样品，每个样品为8g(精确到0.01g)。分别加入适量混合标准溶液，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液，含量均为2.0ng/mL。其他按样品的水解衍生化和净化步骤操作。

6)奶粉混合基质标准校准溶液的制备

称取五个阴性奶粉样品，每个样品为1g(精确到0.01g)。分别加入适量混合标准溶液，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.8μg/kg、1.6μg/kg、4.0μg/kg、8.0μg/kg和16.0μg/kg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液，含量均为2.0ng/mL。其他按样品的水解衍生化和净化步骤操作。

(3)蜂蜜样品

1)试样制备

对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。将试样于常温下保存。

2)水解和衍生化

称取4g试样(精确到0.01g)于50mL棕色离心管中，加入5mL 0.2mol/L盐酸溶液和0.15mL衍生剂，涡旋混合1min，置于37℃恒温箱中保持16h。

3)净化

将上述衍生溶液取出放置至室温，加入3mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH约7.4，倒入下接OasisHLB固相萃取柱的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB柱，待样液全部通过固相萃取柱后用6mL水洗固相萃取柱，弃去全部流出液。用真空泵在65kPa负压下抽干OasisHLB固相萃取柱10min。再用4mL乙酸乙酯洗脱被测物，洗脱液全部收集于25mL棕色离心管中，并在氮气吹干仪上40℃水浴吹干，1mL样品定容液定容。定容液混匀后过0.45um滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱测定。

4)混合基质标准校准溶液的制备

称取五个阴性样品，每个样品为4g(精确到0.01g)，置于50mL棕色离心管中，分别加入适量混合标准溶液，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.2μg/kg、0.5μg/kg、1.0ug/kg、2.0μg/kg和8.0μg/kg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液，含量均为2.0ng/mL。其他按照样品的水解衍生化和净化步骤操作。

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