喹诺酮类药物残留分析技术前处理方法——提取方法

时间：2023-03-25 02:17:52来源：food栏目：食品快速检测阅读：

喹诺酮类药物残留分析技术前处理方法——提取方法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

QNs的分析方法也受到了较大的关注，有关其分析方法的报道也日益增多。近年来，已有多篇文章专门对QNs的分析方法进行了综述。

11.1.4.1 前处理方法

(1)提取方法

QNs残留分析主要采用液液萃取(LLE)的提取方法。近年来，一些新的提取技术，如超声辅助萃取(UAE)、加速溶剂萃取(ASE)、微波辅助萃取(MAE)、超临界流体萃取(SFE)、分散液液微萃取(DLLME)等也开始应用到QNs残留的提取中。

QNs属于两性化合物，不溶于非极性溶剂，溶于极性有机溶剂以及水溶性有机溶剂或酸性、碱性水溶液中。在组织样品提取过程中，通常采用振荡等操作来完成的，有时也使用超声、均质等方法，大部分方法的提取需要重复两次进行，使用的提取溶剂5～100mL不等。常用的有机溶剂包括乙酸乙酯、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、三氯甲烷或二氯甲烷、乙腈-水溶液等。常用的酸(碱)性有机溶剂包括：磷酸-乙腈、乙酸-乙腈、三氯乙酸-乙腈、高氯酸-乙腈、氨水-乙腈、乙酸-甲醇、三氯乙酸-甲醇、HCIO4-H3PO4-甲醇、三氯乙酸溶液等。常用的水溶液包括：10%高氯酸水溶液、磷酸水溶液、HCI溶液、EDTA-Mcilvaine缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、甲酸铵缓冲液(pH3.25)、NaOH溶液等。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

由于QNs为酸碱两性物质，LLE方法通过调节水相的pH来使得被分析物由其中一相转移到另一相，从而实现分析物的提取。Tyczkowska等研究发现，使用碱化溶剂处理奶样品时，碱化溶剂有助于药物的释放。使用酸化或碱化的乙腈/甲醇提取ENR、CIP等QNs时，较使用单纯有机溶剂的效果要强，提取杂质少，回收率高。Roybal等专门研究了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷等对组织中SAR、DAN、ENR和CIP等QNs的提取效率。实验发现，使用酸化的甲醇或酸化的丙酮(pH3.0)较单一或混合纯有机溶剂能有效改善提取效率，回收率可达70%～90%，可能是在酸性条件下，质子化的QNs与样品基质的吸附作用减弱的缘故，利于药物的释放。

氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等常用作LLE的溶剂，也可用缓冲液与三氯甲烷或二氯甲烷合并进行提取和净化QNs，有时还可加入NaCl等以增强溶剂的离子强度进一步提高QNs在有机相中的转移效率，但处理过程复杂、费时，并需要大量的有机溶剂。乙酸乙酯适用于多种基质中QNs的提取，特别是第一代和第二代QNs的提取(如OXO、FLU等)，乙酸乙酯的用量一般为20～100mL，采用普通的涡动混合或振荡即可完成提取。QNs为酸碱两性物质，介质中水分含量约1%时，对QNs的解离状态具有调节作用，无水硫酸钠常被用来提高乙酸乙酯的提取效率，无水硫酸钠的使用量影响待测物的回收率，5mL样品中加入4g无水硫酸钠时，乙酸乙酯的提取效率最高140。Meinertz等发现，使用乙腈-水(1+1，v/v)提取鯰鱼组织中的SAR及其他QNs时，乙腈-水不但可以有效溶解和提取SAR，而且提取杂质较少。另外，从样品基质提取后，通常会用正己烷、乙醚等非极性溶剂进行脱脂。

Schneider等用LLE法净化鸡组织中的CIP、ENR、DAN、SAR、DIF、NOR、ORB和去乙烯基环丙沙星(desethylene ciprofloxacin)。1.0g组织中加入3mL乙腈和0.25mL浓氨水，均质后离心5min(肝脏：2205g；肌肉：2791g)，取上清液。重复提取2次，合并上清液于50mL离心管中，加入3mL正已烷、3mL乙醚和0.25mL1mol/L氯化钠溶液，涡动混合15s，取下层溶液置于玻璃管中，40℃水浴中氮气吹干，吹干后在玻璃管中加入2.0mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH9.0)，涡动15s复溶，过滤后LC分离，荧光检测器定量，多级串联质谱(MSn)确证。在10～200ng/g的添加水平，回收率为60%～93%，去乙烯基环丙沙星、NOR、CIP、DAN、ENR、ORB、SAR和DIF在肝脏组织中的检出限(LOD)分别为0.3ng/g、1.2ng/g、2ng/g、0.2ng/g、0.3ng/g、1.5ng/g、2ng/g、0.3ng/g；肌肉组织中的LOD分别为0.1ng/g、0.2ng/g、1.5ng/g、0.1ng/g、0.2ng/g、0.5ng/g、0.6ng/g、0.2ng/g。

2)超声辅助萃取(ultrasound-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超声波辐射压强产生的强烈机械振动、扰动效应、乳化、扩散、击碎和搅拌等多级，效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。优点是萃取速度快、价格低廉、效率高。王金秋等利用UAE提取猪肌肉中13种QNs，样品用8mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液超声提取15min，10000r/min离心5min，残留组织用磷酸盐缓冲液(pH7.4)重复提取1次，合并上清液，提取液超声15min，10000r/min离心5min，HLB柱固相净化，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定；13种药物在5.0ug/kg、50.0ug/kg、100.0μg/kg三个浓度水平添加，回收率为64.55%～117.62%，日内变异系数(CV)小于14.28%，日间CV小于12.81%，LOD均为1.0μg/kg，定量限(LOQ)均为5.0μg/kg。刘辉等用UAE提取水产品样品中QNs和磺胺类药物，3.00g样品加入3.0g无水硫酸钠和15.0mL乙腈-乙酸乙酯(3+2，v/v)混合液，高速涡旋振荡混合30s，超声10min，12000r/min离心5min，氨基SPE柱净化，UPLC-MS/MS检测。14种药物的LOD均为1μg/kg，回收率为81.2%～116%，相对标准偏差(RSD)为0.72%～9.8%。

3)超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是用超临界流体作为萃取剂，从各种组分复杂的样品中，把所需要的组分分离提取出来的一种分离萃取的新技术。超临界流体的性质介于气体和液体之间，既有液体的高密度，能溶解各种不溶于气体的物质，又有气体的黏度小、渗透力强等特点，可以快速、高效地将被测物从样品基质中萃取出来。超临界流体萃取具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶剂(如CO2)易挥发、提取物较为“干净”、环境污染少、操作条件易于改变等特点。Shen等采用SFE分离鸡肌肉组织中的NOR和OFL，使用含20%甲醇(v/v)的超临界CO2，温度为80℃，压力为300大气压，流速为3mL/min，收集萃取液40℃旋转蒸干，10mL流动相复溶，高效液相色谱(HPLC)分析，NOR和OFL的回收率为70%～87%，LOQ为5ng/g。

4)分散液液微萃取(dispersive liquid liquid microextraction，DLLME)

DLLME是将合适的分散剂和萃取剂的混合溶剂通过微量进样器快速注入到样品溶液中，萃取溶剂以微滴形式分散在溶液中形成浑浊溶液，此时样品溶液中的目标分析物被萃取到萃取剂微滴中。然后，通过离心实现相分离，富集有目标分析物的萃取剂沉积于溶液底部。最后，使用微量进样器移取沉积相注入色谱仪器进行分析检测。DLLME方法操作简单、快速、成本低、富集倍数大，现已成功应用于多种痕量有机物的分析检测。Tsai等建立了DLLME方法净化猪肌肉组织中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。5g组织置于50mL离心管，加入5mL乙腈(含50μL 70%～72%高氯酸)，均质器均质后，加入2g无水硫酸镁和1g氯化钠，振荡混合1min，10000r/min离心4min，取1.5mL含有300μL二氯甲烷(作为提取溶剂)的上层乙腈溶液(作为分散溶剂)快速注入有7.5mL纯水的10mL试管，涡动混合30s，3000r/min离心4min，用1mL注射器将澄清溶液转移至小瓶，少量甲醇洗涤注射器2次，洗涤液放入同一小瓶，40℃氮气吹干，500μL水-乙腈-高氯酸(70%～72%)混合溶液(10+2+88，v/v/v)复溶，过0.45μm滤膜，HPLC分析。方法回收率和LOD分别为93.0%～104.7%和5.6～23.8μg/kg。Moema等采用DLLME方法提取鸡肝样品中的6种QNs。对分散剂类型和用量，提取剂类型和用量以及分散剂中磷酸浓度和组成、pH等参数进行了优化，净化后HPLC分析。线性范围为30～500μg/kg，相关系数范围为0.9945～0.9974；标准偏差(SD)为4%～7%，在三个浓度水平(50μg/kg、100μg/kg和300μg/kg)的添加回收率为83%～102%；LOD和LOQ分别为5～19μg/kg和23～62μg/kg。Alexandra等建立了DLLME-UPLC-MS/MS法检测原料乳中的17种QNs和14种β-内酰胺类药物(青霉素和先锋霉素)，并根据欧盟在决议2002/547/EC对方法进行验证。DLLME萃取效率取决于多项参数，如萃取物和分散溶剂的性质、体积、pH、盐浓度、搅拌时间和离心时间。采用多变量优化法对这些变量进行准确优化。Plackett-Burman设计选择出影响最大的参数，Doehlert设计获取最优条件并应用条件，用两种不同的pH萃取目标组分(酸性QNs和β-内酰胺类pH为3，其他QNs的pH为8)，使用基质匹配标准曲线定量，羟氨苄青霉素LOQ为0.3ng/g，CIP为6.6ng/g，CV低于15%，检测限(CCa)为4.1～104.8ng/g，检测能力(CCβ)为4.2～109.7ng/g，这些值均很接近于此研究中目标药物的MRL，回收率为72%～110%。

5)微波辅助萃取(microwave-assisted extraction，MAE)

MAE是利用微波加热的特性对物料中目标成分进行选择性萃取的方法。它是通过调节微波加热的参数，利用极性分子可迅速吸收微波能量的特性来加热一些具有极性的溶剂，对样品进行微波加热，这样可有效加热目标成分，以利于目标成分的萃取和分离。由于微波加热是利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热，且是由内及外的内部加热，因此热效率高、升温快速均匀，大大缩短了萃取时间，提高了萃取效率。Hermo等对传统提取方法和MAE提取猪肌肉组织中QNs进行了比较。实验结果表明，MAE的净化效果更好、杂质干扰少，可以获得比传统提取方法略低的LOD和LOQ。

徐昊妍建立了QNs残留的MAE方法。5.0g鸡肌肉样品置于50mL聚四氟乙烯微波罐中，加入7.5mL水匀质后，加入17.5mL 0.3%磷酸乙腈，25mL正已烷，微波60℃，15min，以4500r/min离心10min，收集上清液于50mL分液漏斗中。将离心后的鸡肉残渣用5mL 0.3%磷酸乙腈溶液淋洗，合并上清液。上清液于50℃下用N2吹干后，用2mL流动相定容，过0.45μm微孔滤膜后，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定。方法回收率为66%～97.2%，日内和日间的SD分别为0.95%～10.4%和3.8%～13.6%，LOD为2.7～6.7ng/g。

6)加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

ASE是利用在--定温度和压强下，溶剂所具有的特殊物理化学性质来对固体和半固体物质进行萃取，也称为加压液体萃取(pressurized liquid extraction，PLE)、加压流体萃取(pressurized fluid extraction，PFE)或增强的溶剂萃取(enhanced solvent extraction，ESE)。该方法具有速度快、溶剂使用量少、重复性好等特点。厉文辉等采用ASE提取鱼肉中的QNs(OFL、NOR、CIP、SAR、FLE、LOM、DIF、ENR)、磺胺与大环内酯类药物。将草鱼等样品去皮、去骨，切碎后匀浆，冷冻干燥处理后，经研钵研磨均匀。称取0.10g干鱼样品，加入1.5g硅藻土混合均匀，萃取池(34mL)底部铺上1cm厚的硅藻土层，将混匀好的样品填入萃取池，并加入20ng替代物。萃取条件压力10.34MPa、温度70℃、静态萃取时间5min、冲洗溶剂体积为池容积的60%、氮气吹扫时间120s、静态循环2次。将萃取池置于ASE350上，进行加温加压萃取。收集的萃取液转移至心形瓶，37℃水浴真空旋转蒸发至不再有馏出物。向心形瓶中加入100mL超纯水溶解提取物，涡旋振荡后摇匀，HLB固相萃取柱净化，C18柱对药物进行分离，LC-MS/MS检测。22种QNs、磺胺和大环内酯类抗生素药物的回收率为66%～120%，RSD分别为0.7%～16%，方法LOD为0.02～0.6μg/kg。Rodriguez等采用PLE提取婴儿食品中的NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR。提取溶液为乙腈～50mmol/L pH3.0磷酸溶液(80+20，v/v)，萃取温度为80℃，萃取压力2000psi，静态萃取时间5min，静态循环3次。结果QNs的回收率为69%～107%。Herranz等采用PLE提取食用蛋中的CIP、SAR和ENR。提取溶液为乙腈-50mmol/L pH3.0磷酸盐溶液(50+50，v/v)，设置萃取条件为压力1500psi，温度70℃，静态萃取时间5min，冲洗溶剂体积为池容积的50%，静态循环3次。结果回收率为67%～90%，RSD低于17%，CCa为17～24ng/g，CCβ为30～41ng/g。Yu等采用ASE提取动物源食品中15种QNs(MAR、ENO、FLE、OFL、PEF、LOM、DAN、ENR、ORB、CIN、DAT、SAR、DIF、NAL和FLU)，优化了萃取温度和压力、ASE次数等。提取后用Oasis HLB柱净化，HPLC与LC-MS/MS同时测定。添加浓度为10～800μg/kg时，HPLC测定QNs在猪和牛肌肉、肝脏和肾脏以及鸡和鱼等样品中的的添加回收率范围为70.6%～111.1%，RSD小于15%；在HPLC方法中15种QNs的LOD和LOQ分别为3μg/kg和10ug/kg，而在LC-MS/MS方法中分别为0.3ug/kg和1μg/kg。

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