吡唑酮类药残留分析技术前处理——净化方法

时间：2023-03-25 00:56:39来源：food栏目：食品快速检测阅读：

吡唑酮类药残留分析技术前处理——净化方法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(3)净化方法

吡唑酮类药物残留分析的净化方法主要采用液液分配(LLP)和固相萃取(SPE)方法。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP主要通过调节溶液的pH，改变吡唑酮类药物在水相和有机相中的分配系数，从而达到去除脂溶性和水溶性杂质的目的。

Clark等用LC-MS确证牛肾脏中的保泰松，利用保泰松的酸性特性，样品用等质量的水稀释后，用25%氨水碱化，加入乙酸乙酯-乙醚混合溶液进行LLP，离心，弃去有机层，脱去脂溶性杂质，然后用6mol/L HCI酸化氨水提取液，再与四氢呋喃-正己烷(1+4，v/v)进行LLP，将药物转移至有机相，弃去水溶性杂质，然后进行固相萃取净化，LC-MS确证检测。方法LOD为5～10μg/kg，但未测定回收率。

Shively等测定唾液中安替比林和氨基比林，1mL样品加1mL 1mol/L氢氧化钠溶液碱化稀释，再与1mL氯仿LLP提取净化，收集下层的氯仿提取液，蒸干后复溶于二氧己环，进GC测定。安替比林和氨基比林的线性范围均为0～10μg/mL，CV分别为1.7%和2.4%，回收率为87%和95%。

由于安乃近代谢物极性强，在固相萃取柱上保留很弱，经过固相萃取柱净化损失较大，因此沈金灿等在测定牛奶和奶粉中安乃近的4个代谢物(FAA、AAA、MAA和AA)残留时，在样品加入Tris溶液后，用乙腈提取，乙腈提取液与正已烷进行LLP脱脂，提取液中的脂肪得到有效去除。MAA的LOD为0.24ug/kg，AA为0.59ug/kg，AAA为0.20μg/kg，FAA为0.61μg/kg。在添加量5～20ug/kg范围内，4种安乃近代谢物的回收率在80.4%～97.9%之间，RSD均小于9%。Penney 等测定牛奶、牛肉、猪肉中安乃近及其代谢物残留时，直接用甲醇提取，提取液与正己烷LLP脱脂后直接进HPLC分析。牛奶和猪肉样品的CV小于11%，牛肉样品稍大；平均回收率为82%～128%， FAA、AA和MAA的LOD均小于0.02mg/kg，安乃近的LOD小于0.13mg/kg。

2)固相萃取(solid phase extraction， SPE)

根据吡唑酮类药物酸碱性和极性的差异，选择不同的SPE柱进行净化。酸性的保泰松、羟布宗等主要采用C18、苯基、硅胶、硅酸镁、氨基柱、HLB等SPE柱净化，碱性的安替比林、安乃近代谢物等主要采用C18、氧化铝等SPE柱净化。

A. 酸性药物

a. 反相SPE柱

保泰松和羟布宗显酸性，在酸性条件下，增加了反相色谱保留作用，改善了净化效率。Taylor等测定马血浆中保泰松和羟布宗，血浆用PBS溶液稀释后，用C18 SPE柱净化，依次用PBS溶液和正已烷淋洗，用乙酸乙酯-正己烷(1+1，v/v)洗脱，HPLC测定。保泰松和羟布宗的回收率分别为53.5%～63.1%和43.3%～47.2%，CV分别为5.1%和4.0%。液态样品可直接用中性或酸性溶液稀释后过SPE净化，操作较为简单。Simmons等提取血清中保泰松和羟布宗，三氯乙酸提取液上C18小柱净化，用水淋洗，甲醇洗脱，SFC测定。保泰松和羟布宗的LOD分别为0.1μg/mL和1.0μg/mL，CV为0.24%～4.94%，回收率在82%～83%之间。Caturla等测定血浆中保泰松和羟布宗，应用柠檬酸缓冲液调节血浆pH3.4，上苯基SPE柱净化，用正已烷-乙醚(1+1，v/v)洗脱，洗脱液吹干后流动相溶解，HPLC测定。方法回收率大于90%，CV小于7.5%。该方法的优点是应用柠檬酸缓冲溶液可避免盐酸提取时引起的药物降解。

Dowling等报道了牛乳中保泰松残留分析方法。乙腈提取液用等体积的10 mmol/L的维生素C溶液稀释，再用1mol/L盐酸调节pH3后，上Isolute C18 SPE柱净化，依次用3 mL 10 mmol/L维生素C溶液和甲醇-水(10+90，v/v)淋洗，抽干后用3mL正己烷-乙醚(50+50，v/v)洗脱。方法的CCa和CCβ分别为0.70ng/mL和1.19ng/mL，回收率为105.3%，CV为6.7%。

Gentili 等测定牛奶和牛肉中保泰松等15种非甾体类抗炎药物，牛奶用乙腈提取，牛肉用乙腈和丙酮提取，提取液浓缩后用水稀释，过HLB SPE柱净化，用6 mL正已烷淋洗，依次用甲醇和丙酮洗脱。LC-MS/MS 测定牛奶和牛肉中保泰松的CCa 分别为0.71 μg/kg和0.92 μg/kg，CCβ 分别为1.23 ug/kg和1.84 ug/kg，回收率在97%～99%之间。

b.正相SPE柱

Jedziniak等测定牛奶中的保泰松和羟布宗，乙腈提取液上氨基柱SPE净化，用6mL甲酸-乙腈(5+95，v/v)洗脱，LC-MS/MS测定。实验室内CV为7%～28%，回收率为71%～116%。

庞国芳等分析牛、猪、羊、鸡肌肉中的保泰松残留时，将甲醇-0.25mg/mL二硫苏糖醇的乙酸乙酯溶液(1+7，v/v)提取液吹干后，用5 mL甲醇-氨水-二氯甲烷-0.25 mg/mL二硫苏糖醇的乙酸乙酯溶液(1+1+70+70，v/v)溶解，过VARIAN Bond Elut FL (硅酸镁，2g) SPE柱，15 mL冰乙酸-甲醇-二氯甲烷-乙醚溶液(1+2+47+50，v/v)洗脱，洗脱液用氮气吹至近干后，用流动相溶解，进HPLC检测。方法回收率为89.0%～111.49%，RSD在8%以内，LOD为5.0μg/kg。该研究还对甲醇、乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯混合液作为SPE洗脱液的净化效果进行了比较，发现甲醇洗脱会影响定量，采用冰乙酸-甲醇-二氯甲烷～乙醚溶液(1+2+47+50，v/v)洗脱杂质明显减少，效果最好。

Clark等用LC-MS确证牛肾脏中的保泰松时，组织酸化后用四氢呋喃-正己烷(1+4，v/v)提取，提取液上硅胶SPE柱净化，用四氢呋喃-正已烷(1+4，v/v)直接洗脱，确证LOD为5～10μg/kg，回收率未作测定。

正相机制SPE净化，上样样品要尽量不要含有水分，否则影响回收率。

c. 复合SPE柱

Taylor等确证马血浆中保泰松和羟布宗时，C18 SPE柱洗脱液吹干后，复溶于PBS缓冲液，再过Bond-Elut Certify柱(反相和阳离子交换复合填料)净化，分别用甲醇-PBS缓冲液(1+9，v/v)、1.0mol/L乙酸和正己烷淋洗，二氯甲烷洗脱，衍生化后GC-MS确证测定。血液中添加浓度大于4μg/mL时，保泰松和羟布宗可得到确证。

B. 碱性药物

a. 反相SPE柱

沈金灿等测定牛和猪肌肉组织中安乃近的3种代谢物FAA、AA和MAA残留时，将2mL水相提取液加入Bond Elute C18 SPE中，依次用5mL水和5mL甲醇-水(5+95，v/v)淋洗，用5mL甲醇洗脱，LC-MS/MS测定。方法LOD为5μg/kg；测定范围为5～150ug/kg；FAA、AAA、AA和MAA的回收率分别为81.6%～94.0%、81.2%～90.2%、82%～101%和75.0%～86.4%；CV小于7%。通过比较HLB、Bond Elute Certify、Bond Elute C18的富集和净化效果，发现HLB柱对AA的回收率差，Bond Elute Certify对MAA的回收率差，而Bond Elute C18的回收率均比较理想。

b. 正相SPE柱

Jedziniak等测定牛肉中安乃近的4种代谢物(FAA、AAA、AA和MAA)残留时，样品的乙腈-乙酸钠溶液提取液用氧化铝SPE柱净化，收集流出液进LC-MS/MS测定，回收率为45%～95%，CV为7%～30%；MAA的CCa和CCβ分别为113μg/kg和139μg/kg，FAA、AAA和AA的CCa和CCβ均在11.6～16.5μg/kg之间。

Engel等测定安替比林代谢物NORA时，体外肝微粒体酶孵育液用二氯甲烷提取，提取液蒸干后复溶于乙酸乙酯，过硅胶SPE小柱净化，用6mL甲醇-乙酸乙酯(1+9，v/v)洗脱，弃去初始的2mL，收集后4 mL，衍生化后用GC-MS测定。NORA的LOQ为5 ng/mL，CV为19.4%和20.7%，回收率为80%～120%。因为安替比林、NORA与衍生化试剂N- (特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺均生成相同的产物，干扰NORA测定。经过硅胶柱净化，安替比林仍保留在SPE小柱上，只有NORA被洗脱，避免了测定时的干扰。

3)分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)

分子印迹技术是一种制备分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)的技术。由于MIP中具有和目标分子高度互补的功能基团和空腔结构，因此具有对目标分子较好的识别性能。何云华等以甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合成了安乃近的MIP。所制备的MIP与安乃近存在两类不同的结合位点，高亲和力结合位点的离解常数为9.52×10-4 mmol/L，最大表观结合量67.0 umol/g；低亲和力结合位点的离解常数为8.71×10-3 mmol/L，最大表观结合量为240.0 umol/g。其对氨基比林及安替比林的吸附量均较小，表明制备的安乃近MIP具有良好的选择性。

4)液相微萃取(liquid phase microextraction， LPME)

LPME过程是基于分析物在样品与有机溶剂之间分配平衡的过程，分析物在平衡时的萃取量达到最大。黄星等建立了尿液中氨基比林和安替比林的LPME-GC测定方法。在4 mL萃取瓶中加入搅拌磁子和3mL尿样，调节至pH9，用10μL微量注射器抽取1 μL甲苯，将针尖浸入到样液高度一半处，按下微量注射器的活塞，使萃取溶液形成一个小液滴悬挂在针尖上，溶液搅拌速度为170 r/min，萃取15 min后，拉回活塞，直接进GC分析。氨基比林、安替比林的CV为8.14%～16.8%，LOD 分别为1mg/L、4mg/L。

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