液相色谱-串联质谱法测定牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代谢物残留量

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

15.2.1.1 适用范围

适用于牛、猪肌肉和肝脏中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限：卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸均为0.5ug/kg。

15.2.1.2 方法原理

用乙腈+乙酸乙酯(1+1，v/v)溶液提取肌肉和肝脏组织中的卡巴氧，提取液经正己烷脱脂后，旋转蒸发至干，残渣用甲酸(0.1%)+甲醇(19+1，v/v)溶液溶解。样液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。用甲酸溶液消化试样，使组织中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，过Oasis MAX固相萃取柱或相当者净化。先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧，再用2%甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸，氮气吹干洗脱液，残渣用甲酸+甲醇(19+1，v/v)溶液溶解，样液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

15.2.1.3 试剂和材料

甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯；正已烷、乙酸、浓盐酸、乙酸钠、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯：分析纯；中性氧化铝：200～300目：乙腈+乙酸乙酯溶液：(1+1，v/v)。

甲酸乙酸乙酯溶液：2%。向400mL乙酸乙酯中加入10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL；甲酸溶液：0.6%。量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L；甲酸溶液：0.1%。量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L；甲酸+甲醇溶液：(19+1，v/v)。用190mL甲酸溶液与10mL甲醇混合；盐酸溶液：0.1mol/L。量取8.3mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L；盐酸溶液：0.3mol/L。量取25mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L；Protease蛋白酶：Sigma P5147 或相当者，-18℃以下保存；蛋白酶水溶液：0.01g/mL。称取1.00g Protease蛋白酶，用水溶解、定容至100mL，4℃保存；乙酸溶液：10%。量取100mL甲酸，用水溶解、定容至1L；乙酸钠溶液：0.05mol/L，pH=7。称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液以调节溶液pH=7，用水定容至1L；乙酸钠+甲醇溶液：(19+1，v/v)。用190mL乙酸钠溶液与10mL甲醇混合；甲醇+水溶液：(1+4，v/v)；Tris碱：Sigma T1503或相当者；Tris溶液：1.0mol/L。称取121 g Tris碱，用水溶解、定容至1L，4℃保存。卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸、喹噁啉-2-羧酸-d4标准物质：纯度≥99%。

标准储备溶液：100mg/L。准确称取适量标准物质，卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容，其余标准物质分别用甲醇溶解定容，配成100mg/L的标准储备液，在-18℃保存，可使用1年。

基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度(μg/L)的基质混合标准工作溶液，在4℃保存，可使用1周。

内标工作溶液：准确称取适量内标标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/L的标准工作溶液，在4℃保存，可使用1周。

阴离子交换柱： Oasis MAX 60mg，3mL，或相当者。用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱体湿润。

15.2.1.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源；固相萃取装置；氮气浓缩仪；液体混匀器；分析天平：感量0.1mg和0.01g；真空泵；均质器；移液器：10～100uL和100～1000uL；聚丙烯离心管：50mL，具塞；pH计：测量精度±0.02pH单位；低温离心机：可制冷到4℃；玻璃离心管：15mL。

15.2.1.5 样品前处理

(1)试样制备

将牛、猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎，均质，分出0.5kg作为试样，置于清洁样品容器中，密封，并做上标记。将制备好的试样于-18℃以下保存。

(2)卡巴氧的前处理步骤

称取5g试样，精确至0.01g。置于50mL聚丙烯离心管中，加入5g中性氧化铝。加入25mL乙腈+乙酸乙酯溶液，于液体混匀器上充分混合5min，以5000r/min离心5min，将上清液移取至另一干净的50mL离心管，加入10mL正已烷到管内，振荡2min，以5000r/min离心5min，弃去上层正已烷，将下层清液转移至150mL鸡心瓶中。

重复上述步骤一次， 合并2次提取液于同一鸡心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2羧酸-d4标准溶液，使其浓度为2.0ng/g，40℃水浴，减压旋转蒸发至干。准确加入1.0mL甲酸+甲醇溶液溶解残渣，过0.2um滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

(3)脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前处理步骤

称取5g试样，精确至0.01g。置于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL 0.6%甲酸溶液，混匀后，置于47℃±3℃振荡水浴中振摇1h；先加入3mL 1.0mol/L Tris溶液混匀，再加入0.3mL蛋白酶溶液，充分混匀后，置于47℃±3℃振荡水浴中酶解16~18h。加入20mL 0.3mol/L HCI，振荡5min，在10℃以5000r/min离心15 min，上清液过滤。 将滤液移入Oasis MAX固相萃取柱中，待样液全部流出后，用30mL乙酸钠+甲醇溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15 min。在- - 支干净的玻璃管内加入一定量的喹噁啉-2羧酸-d4标准溶液，使其浓度为2.0ngg，再用4×3mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧洗脱至管内，在45℃用氮气浓缩仪吹干。固相萃取柱再用3×3mL甲醇、3mL水、3×3mL 0.1mol/L盐酸和2×3mL甲醇+水溶液溶液分别淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，最后用3mL甲酸+乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸至试管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0mL 0.1%甲酸+甲醇溶液溶解残渣，过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

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