苯并咪唑类药物残留分析技术——净化方法（一）

时间：2023-03-24 23:13:26来源：food栏目：食品快速检测阅读：

苯并咪唑类药物残留分析技术——净化方法（一）

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(3)净化方法

最初的组织样品的处理方法是采用多重液液分配和/或固相萃取净化。一些研究者选择通过液液分配和固相萃取综合净化措施，通常采用HPLC紫外检测；另外一些研究者倾向于采用单一的液液分配净化，采用更具选择性的荧光检测和LC-MS/MS检测。此外，常用的净化方法还有基质固相分散、透析及超滤等。这些简单的净化步骤更适用于分离BMZs混合物，而采用综合净化措施很难同时净化这些药物。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

提取BMZs药物后，根据BMZs与样品中其他成分在互不相溶的溶剂相中的溶解度不同，可通过LLP对样品进行净化。有的研究者采用单一溶剂净化，有的研究者采用多种溶剂进行净化。

Marti等用乙腈和乙腈-水溶液从肌肉、肝脏和肾脏组织中两次提取8种BMZs。提取液用正己烷脱脂后，采用一系列LLP净化措施，包括先加入正已烷、氯化钠，出现三相分层后弃去正已烷层，再加入二氯甲烷LLP，取乙腈层，干燥浓缩后进一步采用C18和Florisil柱净化浓缩，用HPLC-紫外检测器(UVD)检测或气相色谱-质谱(GC-MS)确证分析。除OFZ外，其余BMZs的回收率均大于65%，OFZ在肝和肾的回收率分别为45%和39%，LOD在20～50ng/g范围内

Blanchflower等用甲醇-水(2+7，v/v)从肝脏和肌肉组织中提取FBZ和OFZ，提取液用石油醚洗涤，磷酸缓冲液稀释，再用乙醚-乙酸乙酯(60+40，v/v)萃取。该方法FBZ和OFZ的平均回收率分别为91%和86%，LOD分别为0.05ug/g和0.1ug/g。Fletouris等在酸性条件下，用辛烷磺酸盐离子对从肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中分离提取ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2。提取液用pH8.5的磷酸缓冲液和乙酸乙酯LLP净化，再用高度敏感的离子对HPLC检测。方法回收率均在76%以上，RSD小于7.3%，ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的LOQ分别为20ng/g、0.5ng/g和1ng/g。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是残留分析中常用的净化手段。由于BMZs的理化性质存在差异，多种类型填料的SPE柱都可以被选用。对于非极性或弱极性药物，常采用C18、C2柱；对于极性药物，常采用CN柱；离子型药物可采用离子交换柱；此外，还可使用聚合柱。

A. C18柱

Su等调pH10后用乙腈提取肌肉和肝脏组织中6种BMZs，加入BHT防止TBZ-5-OH氧化，提取物再用C18 SPE柱净化，HPLC测定。DAD检测时，LOD在0.005～0.03μg/mL之间，FLD检测时在0.004～0.02μg/mL之间；回收率在71%～101%之间，日内和日间CV分别为1.92%和7.22%。Allan等用酸稀释血浆后直接过C18柱，SPE柱用20mL水、0.5mL甲醇-水(40+50，v/v)和0.4mL甲醇洗涤，再用1.6mL甲醇洗脱，HPLC检测。MBZ及其主要代谢物的回收率均大于80%；等度洗脱时，MBZ的LOD为20ng/mL，梯度洗脱时，LOD为10ng/mL。Rouan等采用ASPEC系统对血浆中的TCB及其代谢物进行自动液固提取和净化。采用C18一次性萃取柱富集，甲醇洗脱后，再进行色谱分析。对于有限的样品，该试验条件下的回收率大于96%。Hennessy等用饱和碳酸氢钠将胆汁样品调节至pH8.8，再用乙酸乙酯提取，在氮气下吹干，复溶后，过预先用甲醇和水活化的C18 SPE柱，然后用10mL水洗脱，TCB代谢物收集到3mL甲醇中，氮气吹至约0.5mL，HPLC测定。该方法TCB的LOD为20ng/mL，提取效率约在85%～90%之间。Moreno等用乙腈沉淀奶中的蛋白，然后将上清液过预先活化的C18 SPE柱，用水洗涤，甲醇洗脱，再用HPLC-UVD检测。ABZ、FBZ及其代谢物的平均回收率在77%～97%之间。Takeba等用乙腈从奶中提取TCB、TCB-SO和TCB-SO2，然后用正己烷脱脂，乙腈相用碳酸缓冲液调节后，用二氯甲烷萃取，再用C18 SPE柱净化，用2mL纯水洗涤SPE柱，3min抽干，用2mL乙腈洗脱TCB及其代谢物，HPLC-UVD检测。方法平均回收率在89%～95%之间。

B. C2柱

Wilson等用乙酸乙酯从绵羊、牛和猪的肝脏和肌肉组织中提取8种BMZs，接着采用酸化甲醇-正己烷LLP净化，再用C2 SPE柱净化。分别用6mL乙酸乙酯、3mL乙醇和3mL去离子水洗涤SPE柱，并保持柱床水分不能干，向300μL乙醇-盐酸溶液中加2mL 2%碳酸氢钾溶液，混匀，过柱，让其自然流出，用1倍柱体积的水洗涤SPE柱2次，抽干，用900μL乙酸乙酯洗脱药物及其代谢物，40℃氮气吹干，用300μL流动相复溶，HPLC-UVD检测。该研究发现，C2 SPE是最有效的吸附剂，能够比其他SPE吸附剂更好地除去极性基质干扰物，同时能够获得较高的BMZs回收率，所有药物及其代谢物的回收率大于80%。

C. CN柱

Cannavan等在pH7.0条件下，用乙酸乙酯从肝脏、肾脏和肌肉组织中提取TBZ和TBZ-5-OH，然后用CN SPE柱净化。萃取柱预先用4mL正己烷活化，并保持柱床不能干，提取液过柱，抽干10min，然后用2mL含有0.2%(v/v)三乙胺-甲醇溶液2次洗脱，70℃下氮气吹干，用200μL甲醇-乙腈-水(2+1+7，v/v)复溶，混匀，液相色谱-质谱(LC-MS)测定。采用氘代TBZ作为内标，从而提高了方法重复性。TBZ和TBZ-5-OH的回收率分别在96%～103%和70%～85%之间，LOD均小于10μg/kg。

D. 中性氧化铝柱

田德金等用乙酸乙酯做提取剂，提取动物组织中的FLU、FBZ、ABZ和MBZ，提取液浓缩后，用乙腈复溶，正已烷脱脂，然后过中性氧化铝小柱净化，用乙酸乙酯-无水乙醇(4+1，v/v)溶液洗脱，40℃蒸干，残渣用1mL乙腈-水(3+7，v/v)复溶，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定。方法回收率为60%～85%，平均CV小于15%，LOQ为1ug/kg。

E. 氨丙基柱

Hajee等用pH7.5的乙酸乙酯提取鳗鱼肌肉中MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH残留物，加正已烷净化，再过氨丙基SPE柱。用5mL甲醇活化萃取柱，不能流干，分别用2mL乙酸乙酯和2mL乙酸乙酯-正己烷(4+5，v/v)预洗，并保持柱床不能干，加上储液器，将提取液加入储液器，用5mL乙酸乙酯-正己烷(4+5，v/v)洗涤提取液容器并加到储液器过柱，控制流速在2mL/min，用2mL异辛烷洗涤SPE柱，再让SPE柱流干，氮气吹干SPE柱20min，用2mL甲醇洗脱药物到5mL玻璃试管，37℃氮气吹干，1.0mL流动相复溶，涡动混匀，3800g离心5min，上清液HPLC分析。该方法对MBZ-OH的LOD和LOQ分别为0.7ug/kg和1.1μg/kg，对MBZ分别为1.4μg/kg和2.3μg/kg，对MBZ-NH2分别为1.5μg/kg和2.1μg/kg；日间和日内CV均小于5.8%；MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分别为90%、74%和92%。

F. 离子交换柱

Rose等采用乙腈从肝组织中提取9种OFZ代谢物，用乙酸处理后，过强阳离子交换(SCX)柱净化，用丙酮、甲醇和乙腈洗涤，用含有5%氨水的乙腈溶液洗脱，HPLC-UVD测定。药物的回收率在28%～117%之间，FBZ、OFZ、TBZ、TBZ-5-OH的LOD均为5μg/kg。Arenas等测定了牛奶中的TBZ和TBZ-5-OH。乙酸乙酯提取物用PRS阳离子交换柱净化，用含有0.1mol/L KH2PO4的乙腈-水(30+70，v/v)溶液洗脱，HPLC-FLD分析。TBZ、TBZ-5-OH和与硫酸盐结合的TBZ-5-OH回收率分别大于87%、98%和96%，CV小于等于61%。

G. 聚合柱

Balizs等用1mL甲醇-0.1mol/L乙酸铵溶液(50+50，v/v)溶解肌肉提取物，再过聚苯乙烯-二乙烯基-苯(SDB)SPE柱，用3mL甲醇-乙酸乙酯(1+4，v/v)溶液洗脱，LC-MS/MS检测。15种BMZs的回收率在36%～117%之间，但FEB的回收率仅为8%；方法LOD均低于6ug/kg，LOQ大多数低于10μg/kg。杜红鸽等建立了动物肌肉组织中ABZ及其代谢物ABZ-SO、ABZ-SO2的HPLC分析方法。用乙酸乙酯提取肌肉组织样品中的药物，提取液浓缩后用酸性乙醇复溶，正己烷除脂，过HLB柱净化。SPE柱依次用5mL甲醇、5mL水活化，加入样品提取液，以较慢的速度流过后，加入3mL水淋洗，吹干柱内滞留的液体。用6mL甲醇洗脱药物至10mL试管中，50℃氮气吹干，加入1mL流动相溶解残渣，过0.45um微孔滤膜后，进HPLC检测。肌肉样品中平均回收率为86.4%，平均CV为1.96%，3种药物的LOD均为5ug/kg，LOQ均为20ug/kg。

H. 复合用柱

Sorensen等用乙腈从鳟鱼肌肉和皮肤中提取FBZ残留标示物，提取物用正己烷洗涤，然后过C18和CN SPE柱净化。C18萃取柱预先用10mL甲醇、5mL水和5mL pH11.0的磷酸缓冲液活化，提取液过柱，控制流速在2～4mL/min，然后用2mL pH11.0的磷酸缓冲液洗涤，再用2mL 10%甲醇洗涤3次，抽干15min，用5.0mL乙腈洗脱样品，洗脱液在40～45℃下氮气吹干，残渣复溶于50μL DMSO和2.0mL乙酸乙酯和6.0mL正己烷混合液中。CN SPE柱用10mL 1%乙酸甲醇洗涤，接着用5mL甲醇洗涤，抽干2min，接着用8mL乙酸乙酯-正已烷混合液(1+3，v/v)活化，将样品溶液过柱，控制流速在2～4mL/min，用2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合液(1+3，v/v)洗涤5次，抽干5min，化合物用6mL 1%乙酸甲醇洗脱，在40～45℃下氮气吹干，残渣复溶于0.2mL DMF并用流动相稀释至0.8mL，不过滤，HPLC-UVD检测。对于FBZ、FBZ-SO和FBZ-SO2的LOD分别为4.0μg/kg、4.5μg/kg和3.8μg/kg；两种组织中药物的平均回收率均大于86%，RSD低于9.2%。Danaher等用未修饰的超临界CO2从肝脏添加样品中提取14种BMZs，用中性氧化铝柱和SCX柱净化提取物，将储液器与MCX萃取柱相连，萃取柱预先用5mL甲醇-水-冰乙酸(54+36+10，v/v)活化，18mL样品提取液(甲醇-水)加2mL冰乙酸酸化混匀后加到储液器上样，分别用2.5mL丙酮、5mL甲醇和5mL乙腈洗涤萃取柱，5mL乙腈-氨水(95+5，v/v)洗脱药物及其代谢物，60℃氮气吹干，加400μL甲醇-水(50+50，v/v)复溶，再用HPLC-UVD检测。除TBZ、CAM和TCB-SO2不能定量外，其余11种BMZs的平均回收率在51%～113%之间，LOD为50μg/kg，日内及日间CV分别小于10%和32%。

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