食品伙伴网注：本方法源自奶牛乳房炎防治技术指南(试行)（农医发[20l0]29号）

1主要试剂和试验方法：

1.1革兰氏染色：

1.1.1涂片、火焰固定。

1.1.2草酸铵结晶紫染1min。

草酸铵结晶紫染液的配制：

溶液A：结晶紫2g，95％酒精20mL，溶液B：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。将A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用。

1.1.3自来水冲洗。

1.1.4加碘液覆盖涂面染约1min。

1.1.5水洗，用吸水纸吸去水分。

1.1.6加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。

1.1.7沙黄液（稀）染2min后，自来水冲洗。干燥，镜检。

革兰氏阳性菌染色为蓝色，革兰氏阴性菌染色为红色。

1.2触酶试验：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性，无则为阴性。

1.3血浆凝固酶试验：吸取0.5mI。兔血浆与0.5mlj金黄色葡萄球菌浸液肉汤24h培养物充分混匀，置36±1℃培养，每隔半小时观察一次，连续观察6h，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。

2乳样的采集

选取出现临床症状（或者怀疑为亚临床型乳房炎）乳房炎奶牛，先用温水，再用0.2％新洁尔灭擦洗乳房，最后用70％的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2-3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样5mI.于无菌乳样杯中，待检。

3病原菌的分离培养

初步诊断：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。

分离培养：将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤（10％血清）、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基（平板）后，置于37℃温箱培养24～48h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。

普通琼脂平板上，37℃，24～72h培养后，可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、镜检（镜检呈葡萄状排列，无芽胞、荚膜，直径0.5～lμm，革兰氏染色阳性），并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基，经37℃培养24～48h。24h后没有长菌的平板，再用相应的增菌肉汤涂划一次，继续培养，24～48h后，再作检查，以防漏检。将剩余的乳样存放于4℃冰箱内备用。

营养肉汤中呈浑浊生长，管底有少量灰白色沉淀；

血液琼脂平板中菌落较大，呈金黄色、圆形，周围出现明显的β-溶血。

4生化鉴定

触酶试验：触酶阳性

血浆凝固酶试验：凝固酶试验阳性

糖发酵试验：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖

色素产生情况：能产生金黄色色素

5毒力试验

将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释，对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种，接种量为0.5mL／只（家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1～0.5mL），能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。

6病原菌的重分离试验

对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。

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